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阿尔兹海默症(Alzheimer‘s Disease,AD)是一种与年龄相关的渐进性神经退行性疾病,是引起老年人痴呆的最常见原因,目前无特效药治疗,因此亟待寻找新的经济有效的防治策略。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物,人群、动物和细胞实验均提示其具有神经保护作用。大量证据表明维生素D(vitamin D,VD)可能也具有改善AD的作用。此外有细胞实验提示槲皮素和维生素D之间可能存在相互影响,同时流行病学研究提示槲皮素对疾病的效应可能受机体维生素D水平影响。我国中老年人群维生素D缺乏比例很高,而此人群为AD的高发人群。因此,探讨不同维生素D水平下槲皮素对AD的保护作用是否不同及可能机制,能够对具有不同维生素D状态的人群进行槲皮素干预提供理论指导。目的:以APP/PS1双转基因AD小鼠为模型,探讨不同维生素D水平下,槲皮素对小鼠认知功能及AD关键指标[β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)和tau病理学、神经炎症和突触功能]的影响;以及微小RNA(microRNA,miRNA)和肠道菌群在上述病理学过程中的可能作用。方法:随机将28只10周龄雄性APP/PS1小鼠分成4组,分别为对照组(CON,VD摄入水平为1000IU/kg的AIN-93G饲料),低VD水平组(LVD,VD摄入水平为500IU/kg+0.08%槲皮素干预的AIN-93G改良饲料),中等VD水平组(MVD,VD摄入水平为1 000IU/kg+0.08%槲皮素干预的AIN-93G改良饲料)和高VD水平组(HVD,VD摄入水平为1000IU/kg+0.08%槲皮素干预的AIN-93G改良饲料,且每两周肌肉注射一次1000IU维生素D3),共干预20周。干预结束后,进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验,然后进行水迷宫实验测定小鼠的学习记忆能力。实验结束后处死小鼠,分离小鼠血清、海马、皮质和肠内容物,检测如下指标:(1)血清25(OH)D3水平:化学发光免疫分析法测定血清25(OH)D3水平。(2)Aβ和tau病理学指标:利用Western blot法检测海马和皮质中Aβ生成和降解途径关键蛋白胰岛素降解酶(IDE)、金属蛋白酶10(ADAM10)、APP裂解酶1(BACE1)和组织蛋白酶B(Cathepsin B)的表达;同理检测tau蛋白在丝氨酸396和404位点的磷酸化水平(p-tau ser396和p-tau ser404)和tau磷酸化相关蛋白:细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸酯酶2A(PP2A)、AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)和p35/25蛋白的表达。利用刚果红染色法检测海马和皮质中的Aβ斑块表达水平,免疫组化法检检测tau蛋白在丝氨酸202和苏氨酸205位点的磷酸化水平。(3)神经炎症及突触功能相关指标:Western blot法检测海马和皮质中神经炎症和突触功能相关蛋白Nod样受体蛋白3(NLRP3)、离子钙接头蛋白分子1(Ibα1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后密集蛋白(PSD95)、突触素(Synaptophysin)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。利用双重免疫荧光法检测Ibα1和GFAP在大脑的定位表达。(4)miRNA表达量:利用实时荧光定量PCR法检测海马和皮质中miR-26a、miR-125b、miR-138、miR-132 和 miR-219 的表达水平。(5)肠道菌群:收集小鼠肠道内容物,利用16S rDNA高通量测序法检测并分析小鼠肠道菌群多样性及在门和属水平下的群落结构,并进一步分析组间具有显著差异的菌属与AD关键病理指标的相关性。结果:1.小鼠体重、摄食量、糖耐量和胰岛素耐量及血清25(OH)D3水平(1)各组小鼠初始体重无显著性差异,在整个实验期间,各组小鼠体重稳定增长,各组间体重和每日平均摄食量无显著性差异。(2)葡萄糖耐量实验中,各组间血糖曲线下面积(AUC)无显著差异。在胰岛素耐量实验中,LVD组小鼠血糖AUC值较CON组显著升高(p<0.05)。(3)血清25(OH)D3水平:相较于CON组,LVD组和MVD组小鼠分别具有显著降低和升高的25(OH)D3水平(p<0.05)。2.小鼠学习记忆能力指标定位航行实验中,相比与CON组,LVD组小鼠在第3和第4天的逃避潜伏期显著降低(p<0.05)。空间探索实验中,与CON组相比,HVD组小鼠在目标象限的停留时间显著上升(p<0.05),LVD组小鼠穿越平台的次数和在目标象限的游泳总距离显著升高(p<0.05)。3.Aβ和Tau病理学指标(1)Aβ病理学:与CON组相比,在海马组织中MVD和HVD组小鼠的BACE1显著降低,IDE表达显著升高(p<0.05);在皮质组织中LVD组小鼠的ADAM10、BACE1和Cathepsin B蛋白表达水平,以及MVD和HVD组小鼠的BACE1蛋白表达量均显著降低(p<0.05);刚果红染色结果显示,LVD组小鼠的皮质和海马中的Aβ斑块数目明显减少,MVD和HVD组小鼠脑中的斑块数量与CON组小鼠相近。(2)Tau病理学:相较于CON组,LVD组小鼠海马和皮质中的p-tau ser 96和p-tau ser404水平显著降低,MVD组小鼠仅在海马中具有显著降低的p-tau ser396(p<0.05);免疫组化结果显示LVD组小鼠的p-tau ser202和p-tau thr205表达水平显著降低;LVD组小鼠的海马和皮质中的p-ERK1/2和海马组织中的CDK5蛋白表达量显著降低(p<0.05),而各组间PP2A、p-AMPK和p35/25蛋白表达无显著差异。4.神经炎症及突触功能相关指标:相比于CON组小鼠,LVD组小鼠海马组织中的GFAP,皮质组织中的NLRP3及海马和皮质组织中的Iba1表达量显著降低(p<0.05);HVD组小鼠海马中以及MVD组小鼠皮质中的Iba1表达量显著降低。GFAP和Ibα1的免疫荧光结果与蛋白表达水平基本一致。针对突触功能,仅在海马组织中,LVD组小鼠的BDNF显著升高(p<0.05),而各组间PSD95和Synaptophysin蛋白表达量无显著差异。5.miRNA水平:与CON组相比,在海马组织中,LVD组小鼠的miR-26a和miR125b水平显著降低,miR-132表达显著升高,HVD组小鼠的miR-26a表达水平显著降低(p<0.05)。在皮质组织中,各组间miRNA的表达水平无显著差异。6.小鼠肠道菌群结构及与AD病理学指标的相关性(1)肠道菌群多样性及结构:相比于CON组,LVD组肠道菌群的ACE和Chao1指数显著升高(p<0.05)。在门水平上,小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门组成;在属水平上,以脱硫弧菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、Faecalibaculum、Ambiguous_taxa和Lachnoclostridium为优势菌属。与CON组相比,LVD组小鼠Glutamicibacter、Facklamia和Aerococcus的相对丰度显著升高(p<0.05);三个槲皮素干预组小鼠的螺杆菌属、葡萄球菌属和Lachnospiraceae UCG006相对丰度显著升高(p<0.05);MVD和HVD的罗氏菌属以及HVD组的Ruminiclostridium 9菌属相对丰度显著降低(p<0.05);各组间乳杆菌属相对丰度无显著性差异。(2)肠道微生物与AD病理学指标的相关性:在海马组织中,p-tau ser396、p-tau ser404、GFAP、Ibal、miR-26A 和 miR-132 表达水平与 Aerococcus 相对丰度呈显著负相关(p<0.05),p-tau ser404和Ibal表达水平与Facklamia相对丰度呈显著负相关(p<0.05)。在皮质组织中,p-tau ser396、p-tau ser404 表达水平与 Aerococcus相对丰度呈显著负相关(p,0.05)。结论:1.在低维生素D水平下,槲皮素干预组APP/PS1小鼠具有一定程度的胰岛素耐量受损状况。2.在低维生素D水平下,槲皮素干预组APP/PS1小鼠具有被显著改善的认知功能。但在正常和较高维生素D状态下,槲皮素干预后并未发现APP/PS1小鼠的认知功能得到明显改善。3.在低维生素D水平下,槲皮素干预组APP/PS1小鼠的认知功能改善可能与干预降低脑内Aβ斑块数目,缓解tau蛋白磷酸化(特别是ser396、ser404、ser202和thr205位点的磷酸化),减轻胶质细胞神经炎症和提升BDNF水平有关。4.海马中miR-125b、miR-132和miR-26a表达的改变可能也参与了槲皮素干预后低维生素D水平APP/PS1小鼠认知功能改善的过程,可能是通过降低海马中miR-125b水平改善ERK1/2-CDK5通路,进而减轻tau蛋白磷酸化;通过升高海马中miR-132水平,从而改善胶质细胞激活和tau蛋白磷酸化水平;通过降低海马中miR-26a水平从而调节BDNF表达。5.在低维生素D水平下,槲皮素干预组APP/PS1小鼠认知功能的改善可能也与该组小鼠肠道菌群多样性增加及菌群结构变化有关,特别是Facklamia和Aeracocus等菌属相对丰度的提高。