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人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF)是一种可溶性的蛋白质，能够促进并增强多种神经元的存活和分化，而且对受损神经元有修复作用。早老性痴呆、帕金森、糖尿病神经病等一直是困扰人类的神经疾病，目前还没有针对性的药物。本研究利用生物工程方法表达了人类神经营养因子BDNF蛋白，为治疗该类疾病提供了新的思路。 一、原核重组质粒pET32-BDNF的构建和表达 本研究首先采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，以人的血液淋巴细胞总RNA为模板，扩增了人的脑源性神经营养因子(hBDNF)成熟序列的cDNA片段；分别在上下游引物中引入了Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点，克隆到pMD18-T中得到重组质粒pMD18-BDNF；利用PCR和酶切方法筛选阳性克隆，经测序验证，其序列与GenBank上载录的一致。用BamH Ⅰ和Nde Ⅰ酶切pMD18-BDNF，回收363bp的BDNF基因片段，定向插入到原核重组质粒pET32-BDNF，分别用BamH Ⅰ单酶切和BamHⅠ／Nde Ⅰ双酶切鉴定。鉴定正确后的重组子pET32-BDNF转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导原核重组载体获得融合蛋白；SDS-PAGE分析表明，大肠杆菌表达菌株经1mmol／L IPTG诱导4h后，可表达一单体分子量为14kD的蛋白质，表达量约为菌体总蛋白的15.8％，Western blotting检测表明该表达产物具有免疫活性。 二、真核重组质粒pPIC9K-BDNF的构建和表达 以上面测序得到的重组质粒pMD18-BDNF为模板，扩增了hBDNF基因片段，分别在上下游引物中引入了SnaB Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点。为了避免PCR扩增的突变，将BDNF再次克隆到pMD18-T中得到重组质粒T-BDNF，酶切筛选得到12个阳性克隆。经测序验证，得到一个序列完全正确的BDNF基因片段。用SnaB Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切重组质粒T-BDNF，回收391bp的BDNF基因片段，定向插入到真核重组质粒pPIC9K-BDNF中，采用PCR和酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒pPIC9K-BDNF导入巴斯德毕赤酵母P.Pastori。采用PCR扩增筛选23个重组子，得到21个阳性克隆。进一步采用4个浓度梯度的G418筛选，得到具有G418 1.0mg／ml抗性的3个重组子。重组P.Pastori经甲醇培养基诱导表达96h后，经SDS-PAGE检测，17号重组子能够正确表达；经ELISA检测证实，发现另1个表达菌株也能够正确表达外源蛋白。