目的:大肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一,在人群中有较高的发病率,随着生活水平的提高和饮食结构的改变,其发病率呈逐年上升之势。世界范围内每年新增病例呈逐年上升,流行病学调查研究发现,各个国家地区之间的大肠癌发病率存在着显著差异,在一些发达国家诸如澳洲、西欧、北美等发病以50-60/10万居于最高,亚洲较低,全球范围内每年约有40万人死于大肠癌。我国大肠癌的发病率与死亡率仅次于胃癌、肺癌、食管癌等常见的恶性肿瘤,是威胁人类健康的一大问题。其起病隐袭,发展缓慢,早期症状不明显,晚期出现便血、梗阻、腹部肿块等症状,严重危害人类生命健康。大肠癌发病机制复杂,侵袭和转移是其预后差的主要原因,也是目前大肠癌研究的重点和难点。大肠癌恶性程度高,只有约75%的患者适宜于根治手术,约20%左右的患者就诊时已出现远处转移。大肠癌术后复发率高,死于复发或者转移的患者约占约40%~70%。与其发生发展相关的分子机制一直是人们关注的热点,大肠癌的发生发展是一个由多因素参与、多步骤、多基因突变、多阶段进展的过程,有多条信号转导通路互相作用并互相调节。信号转导通路的异常是大肠癌发生发展的主要因素。信号转导通路与细胞生长增殖、分化、凋亡和代谢等一系列生理活动密切相关。并参与肿瘤细胞的分化、增殖以及调亡。细丝蛋白A(Filamin A,FLNa)又称ABP-280。FLNa与Filamin B,Filamin C共同组成Filamin家族,其分子量280k Da,是一种非肌性肌动蛋白结合蛋白,其基因结构高度保守,对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。FLNa广泛存在于细胞浆,少数跨膜或存在于细胞核内。FLNa是“V”形的同型二聚体,由肌动蛋白结合区、24个重复β-折叠片层结构以及两个绞链区组成,一方面,其氨基末端可与肌动蛋白丝交联而形成稳定的细胞骨架,另一方面,其羧基末端可与细胞膜上的多种蛋白(如表皮生长因子受体)结合,进一步激活其下游如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多条信号转导通路,进而影响肿瘤的增殖、粘附、迁移和侵袭等行为。FLNa作为细胞内绞手架蛋白,为细胞内各种信号网络中的蛋白分子提供绞手架。国外越来越多证据表明,FLNa与肿瘤发生、发展有关,Zhu认为FLNa可调控人恶性黑色素瘤细胞表皮生长因子受体的活化,而FLNa是否对大肠癌SW480细胞表皮生长因子受体的活化及MAPK/ERK、PI3K/Akt转导通路激活造成影响,目前尚无报道。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)又称Erb B-1,是原癌基因c-erb B-1的表达产物,分子质量为170KD。其与Erb B-2/HER-2、Erb B-3/HER-3和Erb B-4/HER-4共同组成受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族。这些受体酪氨酸激酶家族成员均具有三个结构域,胞外区(配体结合区)、跨膜区以及胞内区(酪氨酸激酶结构域)。其中酪氨酸激酶活性代表了它的有效结构,并且是信号传导的基础,其特异性的配体,如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双向调节蛋白(AR)与其结合后,可导致胞内酪氨酸激酶域活化,从而形成同源或异源二聚体,引起下游多条信号转导通路如MAPK/ERK、PI3K-Akt等激活,进一步影响肿瘤的发生发展。EGFR信号转导通路在大肠癌(colorectal cancer,CRC)形成中具有重要的作用,65%~70%的大肠肿瘤中EGFR为高表达,EGFR的表达与肿瘤临床分期、淋巴结受累及范围、血管浸润转移等关系密切。EGFR是酪氨酸激酶家族中最重要的成员,其过表达及活化与大肠癌的发生、发展密切相关。PI3K/Akt通路是目前研究肿瘤发生的热点,丝苏氨酸激酶(serine/threonine,Akt)是由480个氨基酸组成的蛋白激酶,由三部分构成:氨基末端的PH结构域,中部的催化活性区和羧基末端的调节活性区。Akt与许多肿瘤的生物学特性都有关系,包括抑制细胞凋亡,促进细胞侵袭和转移,引起细胞增殖,促进血管生成等。Akt为存在于多个信号转导通路中的效应蛋白,起着关键的中枢作用,其对于维持细胞正常生理功能发挥重要作用。可对细胞进行磷酸化修饰,磷酸化修饰作用失调导致细胞恶性转化及肿瘤发生。p-Akt是Akt的活化形式,只有在活化状态下才具有生物学活性,在PI3K作用下充分激活,参与介导细胞生长、增殖。PI3K/Akt信号通路参与了多种肿瘤的发生、发展及转移。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,定位于胞浆,激活后转位至胞核。其主要受上游蛋白EGFR调控,Ras-Raf-1-MEK-ERK信号转导通路激活后,可调节转录因子活性,导致细胞增殖、分化。Ras-Raf-1-MEK-ERK信号转导通路是细胞外信号通路,在大多数肿瘤侵袭和转移过程中起着非常重要的作用。ERK家族包括ERK1-ERK5亚族,其中ERK1和ERK2表达广泛,功能涉及有丝分裂及分裂后期等一系列的细胞生理活动的调节。本研究首先对大肠癌细胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480进行筛选,通过蛋白印迹(Western blot)方法选取高表达FLNa的SW480细胞作为本研究所用。通过质粒转染技术下调FLNa的表达,通过蛋白印迹(Western blot)验证沉默效果。利用MTS(增殖实验)、Wound healing(划痕修复实验)和Transwell(侵袭实验)观察FLNa对大肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响。经Western blot实验方法进一步从EGFR及其下游信号转导通路中各分子的活化水平进行探讨FLNa对大肠癌SW480细胞的调控机制。收集临床标本,通过免疫组织化学法探讨人大肠癌组织中FLNa的表达与临床病理的关系。本研究分以下三个部分:第一部分细丝蛋白A对体外培养大肠癌细胞生物学行为的影响方法:1细胞复苏和培养将大肠癌细胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480冻存管从液氮中取出,融化后用含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640培养基在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。2 Western blot法检测不同大肠癌细胞中FLNa的表达情况培养不同大肠癌细胞株HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480,Western blot法检测各细胞株FLNa的表达水平。3质粒转染技术建立沉默FLNa的大肠癌SW480细胞株将细胞分为三组:空白组,对照组及实验组,其中空白组不进行处理,将FLNash RNA质粒及阴性对照质粒分别转染人大肠癌细胞SW480,经嘌呤霉素抗性筛选后得到稳定转染的沉默FLNa表达的SW480细胞株(SW480/KD)及对照组细胞株(SW480/Ctrl);利用Western blot检测3组细胞中FLNa蛋白的表达水平。4 MTS比色分析法分别检测2组稳定转染细胞株的增殖能力分别将SW480/KD细胞及SW480/Ctrl细胞消化后接种于96孔板,给予不同浓度(浓度依次为0n M、4n M、20n M、100n M)的EGF刺激,而后加入MTS,在酶标仪490纳米波长处对96孔板进行吸光度值的测定,检测2组稳定转染细胞株的增殖能力。5 Wound healing实验对2组稳定转染细胞株分别进行各个时间点的迁移能力的检测SW480/KD及SW480/Ctrl细胞消化后分别接种于无菌的24孔板,用不含胎牛血清的不完全1640培基饥饿4小时后,用10μl的移液器吸头垂直孔底进行划痕,并将两种细胞各自分别分为无EGF刺激组和20n M EGF刺激组,显微镜下观察划痕愈合情况,并计时拍照。6 Transwell法对2组细胞分别进行的侵袭能力的检测将基质胶铺于Transwell小室的上室,将SW480/KD及SW480/Ctrl两组细胞接种于上室,上室培养液不含胎牛血清,下室培养液含10%胎牛血清,孵育24h后将小室取出,95%冰乙醇固定、HE染色,显微镜下统计穿过微孔膜细胞数目。结果:1不同大肠癌细胞株中FLNa的表达情况利用Western blot检测大肠癌细胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480细胞中FLNa蛋白表达相对灰度值分别为(0.02±0.00),(0.02±0.00),(0.00±0.00),(0.05±0.00),(0.02±0.00),(0.09±0.00)。其中SW480细胞中FLNa的表达水平是最高的(P<0.01)。2稳定转染细胞中FLNa的蛋白水平检测Western blot检测稳定转染细胞FLNa蛋白的水平,结果显示,SW480/KD细胞FLNa的相对表达量(0.48±0.00)明显低于SW480/Ctrl细胞(1.13±0.03),有统计学意义(P<0.01)。3稳定转染细胞的增殖情况MTS法检测2组稳定转染的大肠癌细胞的增殖能力,其结果分别为:SW480/KD组各浓度的OD值(0.99±0.03,1.23±0.04,1.52±0.01,1.90±0.01)明显高于SW480/Ctrl组(0.49±0.00,0.70±0.00,0.98±0.01,1.31±0.04),均有统计学意义(P<0.01)4稳定转染FLNa大肠癌细胞株的迁移情况利用划痕修复实验检测2组稳定转染的大肠癌转染细胞(每组分为EGF刺激及无EGF刺激)的迁移能力,其结果分别为:无EGF刺激时,SW480/KD组各时间点的迁移率(0h,8h、16h、24h)(0.00±0.00,5.67±1.03%,19.85±0.95%,32.42±1.71%)均明显高于SW480/Ctrl组(0.00±0.00%,4.95±0.37%,9.94±0.44%,19.34±0.23%),均具有统计学意义(P<0.01);给予20n M EGF刺激时,SW480/KD组各时间点的迁移率(0.00±0.00%,11.56±1.47%,21.57±0.47%,50.00±0.00%)均明显高于SW480/Ctrl组(0.00±0.00%,6.19±0.51%,9.94±0.44%,22.27±0.26%),均有统计学意义(P<0.01)。5稳定转染细胞的侵袭情况Transwell法检测稳定2组转染大肠癌细胞的侵袭能力,其结果分别为:SW480/KD组穿过微孔膜细胞数(62±3)明显高于SW480/Ctrl组(18±1),有统计学意义(P<0.01)。第二部分细丝蛋白A影响大肠癌细胞生物学行为的机制研究方法:Western blot检测稳定2组细胞FLNa、EGFR、p-EGFR、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK蛋白表达情况。对两组细胞分别在0min、5min、10min、30min给予20n M EGF刺激,收集细胞后,提取蛋白,进行蛋白定量,然后Western-blot检测各时间点FLNa、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、p-ERK、ERK蛋白的表达情况,统计分析。结果:沉默FLNa的表达对大肠癌细胞SW480 EGFR活化的影响统计结果显示,经EGF刺激各时间点(0min、5min、10min、30min)FLNa的表达量:SW480/KD组(0.38±0.05,0.41±0.03,0.32±0.02,0.34±0.06)均明显低于SW480/Ctrl组(0.92±0.08,0.89±0.07,0.88±0.06,0.90±0.05)的表达水平,均有统计学意义(P<0.01);SW480/KD组p-EGFR水平于刺激后5min、10min、30min后的表达水平(0.40±0.09,0.33±0.06,0.25±0.04)均明显高于SW480/Ctrl组(0.27±0.08,0.13±0.02,0.05±0.04),均有统计学意义(P<0.01);SW480/KD组p-ERK的表达水平分别为(0.39±0.02,0.49±0.08,0.34±0.06)均明显高于SW480/Ctrl组(0.30±0.01,0.16±0.01,0.11±0.01),均有统计学意义(P<0.01);SW480/KD组p-Akt的表达水平(1.36±0.12,1.02±0.15,0.85±0.09)均明显高于SW480/Ctrl组(0.60±0.034,0.21±0.02,0.05±0.01),均有统计学意义(P<0.01)。第三部分大肠癌组织中细丝蛋白A蛋白表达与临床病理特征的相关性方法:随机选取82例经手术切除确诊为大肠癌的石蜡标本,病例资料完整,采用免疫组织化学第二代聚合酶二步法(PV)检测其FLNa、EGFR和Ki-67的在大肠癌组织中的表达情况。分析研究FLNa在大肠癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性。结果:1 FLNa在大肠癌组织中主要为胞浆染色,EGFR在大肠癌组织中主要分布在细胞膜和细胞质,阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状,胞核不着色。FLNa蛋白阳性表达率为51.2%(42/82),EGFR蛋白表达阳性率为52.4%(43/82)。Ki-67蛋白在细胞核表达,阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒状,阳性表达率为53.7%(44/82)。2 FLNa和Ki-67与大肠癌临床病理特征的关系在82例大肠癌组织中,FLNa蛋白的表达与年龄、性别和肿瘤大小、分化程度等无关;与有无淋巴结转移和临床分期有关,其差异均有统计学意义(P<0.01)3 FLNa与Ki-67在大肠癌组织中表达的相关性FLNa和Ki-67表达共阳性者16例,共阴性者12例,二者的表达呈负相关(r=-0.320,P<0.01)。4 EGFR与Ki-67在大肠癌组织中的表达相关性EGFR和Ki-67表达共阳性者25例,共阴性者30例,二者的表达呈正相关(r=0.339,P<0.01)。结论:1体外实验表明下调FLNa表达可促进大肠癌细胞SW480的增殖、迁移和侵袭能力;2 FLNa通过调控大肠癌细胞EGFR的磷酸化,影响MAPK/ERK、PI3K/Akt信号转导通路活化,进而影响其一系列生物学行为;3 FLNa表达程度与人大肠癌组织临床分期及淋巴结转移有关,FLNa在大肠癌组织表达与Ki-67呈负相关,抑制肿瘤生长。