病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是心功能不全发生发展的重要原因之一。病毒感染是病毒性心肌炎发病的主要原因,其中以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染最为常见。病毒性心肌炎心肌损伤与心肌局部浸润的炎症细胞有关。巨噬细胞是VMC心肌组织浸润的主要炎症细胞之一,在VMC心肌损伤修复中发挥重要作用。最近研究发现,心肌组织存在胚胎来源巨噬细胞(CCR2-巨噬细胞)和单核细胞来源巨噬细胞(CCR2+巨噬细胞),在心肌梗死小鼠和缺血性心肌病患者心肌组织中发挥免疫调节作用。CCR2+巨噬细胞具有促进炎症反应加重心肌损伤的作用,而CCR2-巨噬细胞促进心肌修复。CCR2-巨噬细胞通过增殖维持自身平衡,CCR2+巨噬细胞通过增殖和外周血单核细胞浸润补充。在急性VMC小鼠模型,心肌组织可见大量单核细胞、巨噬细胞浸润。不同来源的巨噬细胞可能参与VMC心肌损伤修复过程,但是,在VMC发病过程中,心肌组织CCR2+巨噬细胞和CCR2-巨噬细胞的生物学特征及其作用目前仍不清楚。在心肌梗死小鼠模型中,CCR2基因缺陷的心肌梗死小鼠心肌组织单核细胞浸润下降,心肌组织CCR2+巨噬细胞浸润减少,心肌损伤程度减轻。抑制心肌组织单核细胞浸润能够减少心肌组织CCR2+巨噬细胞浸润。我们的前期研究发现,B细胞通过分泌细胞因子加重VMC心肌损伤。在心肌梗死小鼠模型中,B细胞通过分泌CCL7促进单核细胞募集趋化至心肌损伤部位,加重心肌损伤。B细胞能够通过分泌趋化因子促进心肌组织单核细胞浸润,B细胞可能具有调节心肌巨噬细胞亚群的作用。但是,在VMC,B细胞是否调节心肌巨噬细胞亚群?其机制如何?目前未见相关研究报道。巨噬细胞具有功能多样性、可塑性强的特点。在不同微环境中,巨噬细胞可分化为经典激活巨噬细胞(M1)和选择性激活巨噬细胞(M2)。巨噬细胞向M1和M2分化称为极化。在VMC,通过抑制巨噬细胞向M1极化或促进巨噬细胞向M2极化能够减轻心肌炎症程度。LPS和IFN-γ通过活化STAT1信号通路促进巨噬细胞向M1极化。我们的前期研究发现,在VMC,心肌组织IFN-γ显著升高,B细胞缺陷的VMC小鼠心肌组织IFN-γ显著降低。因此,在VMC,B细胞可能促进心肌巨噬细胞向M1极化加重心肌损伤。但是目前未见相关研究报道。基于上述问题,本研究从心肌巨噬细胞来源和巨噬细胞极化两个方面探讨B细胞对VMC小鼠心肌巨噬细胞的作用及其机制,研究内容包括三部分:(1)病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群及其抗原呈递功能变化;(2)B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群的影响及其机制;(3)B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞极化的影响及其机制。第一部分病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群及其抗原呈递功能变化研究一病毒性心肌炎小鼠模型建立目的:腹腔注射CVB3感染C57BL/6小鼠建立小鼠VMC模型,观察不同时间点VMC小鼠心肌组织病理改变。方法:5-6周龄雄性C57BL/6小鼠80只,随机分为对照组(n=40)和VMC组(n=40)。每组分为4个亚组(1周、2周、3周、4周),每个亚组10只。VMC组每只小鼠腹腔注射0.1ml CVB3病毒液,对照组每只腹腔注射0.1ml磷酸盐缓冲液(PBS)。相应时点处死小鼠,留取心脏做苏木精-伊红(hematoxylin&eosin,HE)染色,光镜下观察心肌组织病理变化,并计算病理积分。结果:VMC组小鼠第1周心肌可见大量炎症细胞浸润,心肌细胞局灶性坏死、心肌细胞肿胀,心肌断裂。随后心肌炎症细胞浸润逐渐减少。VMC组心肌病理积分显著高于对照组(P<0.01);VMC组第1周心肌病理积分最高。结论:腹腔注射CVB3感染C57BL/6小鼠能够成功建立小鼠VMC模型。CVB3感染后1周心肌局部炎症损伤最明显。研究二病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群及其抗原呈递功能变化目的:观察VMC发病过程中心肌巨噬细胞亚群变化及共刺激分子在心肌巨噬细胞亚群的差异表达。方法:5-6周龄雄性C57BL/6小鼠144只,随机分为对照组(n=64)和VMC组(n=80)。每组分为4个亚组(1周、2周、3周、4周),对照组每个亚组16只,VMC组每个亚组20只。VMC组每只腹腔注射0.1ml CVB3病毒液,对照组每只腹腔注射0.1ml PBS。在相应时点处死小鼠,留取心脏。用流式细胞术检测各组小鼠心肌CCR2+巨噬细胞(CCR2~+F4/80~+CD45~+)和CCR2-巨噬细胞(CCR2~-F4/80~+CD45~+)表达变化和CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在心肌CCR2+巨噬细胞和CCR2-巨噬细胞表面表达变化。结果:与对照组比较,VMC组小鼠心肌CCR2+巨噬细胞亚群比例显著升高(P<0.01),在第1周达到最高,随后逐渐下降,第4周仍高于对照组(P<0.01)。而VMC组小鼠心肌CCR2-巨噬细胞亚群比例显著低于对照组(P<0.01),在第1周降至最低,随后逐渐升高,第4周仍低于对照组(P<0.01)。CD80和CD40主要在CCR2+巨噬细胞表面表达,而CD86和MHC-II在CCR2+巨噬细胞和CCR2-巨噬细胞表面均有表达。VMC组CCR2+巨噬细胞表面CD80、CD40、CD86、MHC-II表达显著高于对照组(P<0.01),在第1周表达最高,分别为36.29±2.14,55.98±3.26,29.66±2.56,79.75±3.83,随后下降,第4周将至最低,分别为12.75±0.96,11.13±1.73,13.46±1.76,65.08±2.50。VMC组CCR2-巨噬细胞表面CD80表达水平显著高于对照组(P<0.01),在VMC 1周亚组,CCR2-巨噬细胞表面CD80表达水平显著高于对照组(2.46±0.08 vs 1.69±0.18,P<0.01),但是VMC各亚组间比较无显著差异(P>0.05)。VMC组CCR2-巨噬细胞表面CD86表达水平显著高于对照组(P<0.01),CCR2-巨噬细胞表达CD86在第1周最低(10.80±1.9),第3周表达最高(16.66±0.83)。VMC组CCR2-巨噬细胞表面CD40表达在第1周、第2周显著高于对照组(P<0.01),在第1周最高(1.78±0.27),第3周下降至对照组相当水平。CCR2-巨噬细胞表面MHC-II表达水平显著低于对照组(P<0.01),在第1周降至最低(19.00±4.80),随后逐渐升高,第4周表达最高(35.05±2.57),但仍显著低于对照组。结论:在VMC小鼠发病过程中,病毒感染后1周,心肌CCR2+巨噬细胞显著升高并达到高峰,而CCR2-巨噬细胞显著下降,第1周最低,随着心肌炎症逐渐恢复,CCR2+巨噬细胞逐渐下降,CCR2-巨噬细胞逐渐升高。CCR2+巨噬细胞抗原呈递功能活化程度强于CCR2-巨噬细胞。第一部分结论:在VMC小鼠发病过程中,心肌局部炎症损伤最明显时,心肌CCR2+巨噬细胞显著升高并达高峰,而心肌CCR2-巨噬细胞降至最低,随着心肌炎症减轻,心肌CCR2+巨噬细胞逐渐下降,CCR2-巨噬细胞逐渐升高;CCR2+巨噬细胞抗原呈递功能活化程度强于CCR2-巨噬细胞。第二部分B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群的影响及其机制研究一B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞亚群的影响目的:观察B细胞对VMC小鼠心肌巨噬细胞亚群的影响。方法:5-6周龄雄性C57BL/C小鼠16只,随机分为对照组和WT组,每组8只;5-6周龄雄性BKO小鼠16只,BKO小鼠分为BKO组和BKO+B cell组,每组8只。BKO+B cell组:磁珠分选WT组小鼠脾脏B细胞,腹腔注射CVB3前1天将分选的B细胞腹腔注射至BKO组小鼠。WT组、BKO组、BKO+B cell组腹腔注射0.1ml CVB3病毒液,对照组腹腔注射0.1mlPBS。CVB3感染后1周,处死各组小鼠,留取心肌组织行HE染色,计算各组心肌病理积分。流式细胞术检测各组小鼠心肌CCR2+巨噬细胞(CCR2~+F4/80~+CD45~+)和CCR2-巨噬细胞(CCR2~-F4/80~+CD45~+)频数变化结果:对照组小鼠心肌组织无炎症细胞浸润。WT组、BKO组和BKO+B cell组小鼠心肌组织均出现不同程度炎症细胞浸润、局灶性心肌细胞肿胀、坏死。BKO组(1.54±0.21)和BKO+B cell组(2.09±0.34)的心肌病理积分显著低于WT组(3.08±0.37)(P<0.001),而BKO组病理积分显著低于BKO+B cell组(P<0.01)。BKO组小鼠心肌CCR2+巨噬细胞比例显著低于WT组(P<0.01),而BKO+B cell组心肌CCR2+巨噬细胞比例高于BKO组(P<0.05)。BKO组小鼠心肌CCR2-巨噬细胞比例显著高于WT组(P<0.01),BKO+B cell组心肌CCR2-巨噬细胞比例显著低于BKO组(P<0.05)。结论:在VMC小鼠,B细胞加重心肌炎症损伤;B细胞促进心肌组织CCR2+巨噬细胞浸润,抑制心肌组织CCR2-巨噬细胞浸润。研究二B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌单核细胞浸润和单核细胞趋化因子的影响目的:观察B细胞对VMC小鼠心肌组织单核细胞浸润和CCL2、CCL7表达水平的影响。方法:实验动物、分组方法、模型建立方法同本部分研究一。用流式细胞术检测CVB3感染后1周各组小鼠心肌CCR2+单核细胞(CCR2+Ly6G-CD11b+细胞)表达变化。磁珠分选对照组和VMC组小鼠的脾脏B细胞,体外培养48小时后留取培养上清液,用ELISA检测B细胞培养上清液CCL2、CCL7蛋白的表达变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测B细胞和心肌组织CCL2、CCL7 mRNA表达变化。结果:WT组心肌CCR2+单核细胞显著高于对照组(P<0.01),BKO组显著低于WT组(P<0.01),BKO+B cell组显著高于BKO组(P<0.01)。WT组心肌组织CCL2 mRNA和CCL7mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01),BKO组心肌组织CCL2 mRNA和CCL7mRNA表达水平显著低于WT组(P<0.01),而BKO+B cell组高于BKO组(P<0.01)。VMC组脾脏B细胞CCL2 mRNA、CCL7 mRNA水平显著高于对照组(P<0.01),VMC组脾脏B细胞培养上清液CCL2、CCL7蛋白水平显著高于对照组(P<0.01)。结论:在VMC小鼠,B细胞分泌CCL2、CCL7、促进心肌组织CCL2、CCL7表达,促进心肌组织CCR2+单核细胞浸润。第二部分结论:在VMC小鼠,B细胞分泌CCL2、CCL7,增加心肌组织CCL2、CCL7表达水平,促进心肌组织单核细胞浸润,增加心肌CCR2+巨噬细胞浸润,加重心肌损伤。第三部分B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞极化的影响及其机制研究一B细胞对病毒性心肌炎小鼠心肌巨噬细胞极化的影响目的:体内观察B细胞对VMC小鼠心肌巨噬细胞极化影响。方法:5-6周龄雄性C57BL/C小鼠16只,分为对照组和WT组,5-6周龄雄性B细胞缺陷(BKO)小鼠8只,分为BKO组和BKO+B cell组,每组8只。BKO+B cell组:磁珠分选WT组小鼠脾脏B细胞,腹腔注射CVB3前1天将分选的B细胞腹腔注射至BKO组小鼠。WT组、BKO组和BKO+B cell组小鼠每只腹腔注射0.1ml CVB3病毒液,对照组每只小鼠腹腔注射0.1mlPBS,1周后处死各组小鼠,流式细胞术检测各组小鼠心肌组织M2巨噬细胞(CD206+F4/80+CD11b+、Arg1+F4/80+CD11b+)和M1巨噬细胞(NOS+F4/80+CD11b+)频数变化。结果:BKO组小鼠心肌组织M2频数较WT组显著升高(P<0.01),BKO+B cell组心肌组织M2频数较BKO组显著降低(P<0.01)。BKO组心肌组织M1频数较WT组显著降低(P<0.01),BKO+B cell组心肌组织M1频数较BKO组显著升高(P<0.05)。结论:在VMC小鼠,B细胞促进心肌巨噬细胞M1极化,抑制心肌巨噬细胞M2极化。研究二STAT1信号转导通路在B细胞促进巨噬细胞M1极化中的作用目的:探讨STAT1信号转导通路在B细胞促进巨噬细胞M1极化中的作用。方法:实验动物、分组方法、模型建立方法同本部分研究一。流式细胞术检测各组小鼠心肌巨噬细胞磷酸化STAT1水平。磁珠分选对照组和WT组小鼠脾脏B细胞并体外培养48小时后收集上清液。体外诱导骨髓来源巨噬细胞为M2,取B细胞培养上清液分别与M2共培养。具体分组为:1对照组:对照组小鼠脾脏B细胞上清液+M2;2 VMC组:VMC小鼠的脾脏B细胞上清液+M2;3 VMC+氟达拉滨组:VMC小鼠的脾脏B细胞上清液+氟达拉滨+M2。流式细胞术检测CD206+F4/80+CD11b+细胞(M2)频数,ELISA检测各组培养上清液TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-10蛋白水平,RT-PCR检测培养后巨噬细胞TNF-α、IL-12、IL-1β、IL-10、NOS mRNA表达水平。结果:BKO组心肌巨噬细胞磷酸化STAT1表达较WT组显著降低(P<0.01),BKO+B cell组心肌巨噬细胞磷酸化STAT1表达较BKO组显著升高(P<0.05)。骨髓来源巨噬细胞体外诱导为M2比例达到98.4%,VMC组M2频数较Control组显著下降(P<0.01),VMC+氟达拉滨组M2频数较VMC组显著升高(P<0.01)。VMC组培养上清液IL-12、TNF-α、IL-1β浓度显著高于对照组和VMC+氟达拉滨组(均P<0.01),VMC组培养上清液IL-10浓度显著低于对照组和VMC+氟达拉滨组(均P<0.01)。VMC组巨噬细胞IL-12、TNF-α、IL-1β、NOS mRNA表达水平显著高于对照组和VMC+氟达拉滨组(均P<0.01)。结论:在VMC小鼠中,B细胞促进心肌巨噬细胞STAT1信号通路活化;B细胞分泌的细胞因子通过STAT1信号转导通路促进巨噬细胞向M1极化。第三部分结论:在VMC小鼠中,B细胞促进心肌巨噬细胞向M1极化,并且与STAT1信号通路有关。本研究结果表明:(1)在VMC小鼠发病过程中,病毒感染后1周心肌局部炎症损伤最明显时,心肌CCR2+巨噬细胞显著升高并达高峰,而心肌CCR2-巨噬细胞降至最低。随着心肌炎症减轻,心肌CCR2+巨噬细胞逐渐下降,CCR2-巨噬细胞逐渐升高。(2)在VMC小鼠发病过程中,心肌组织CCR2+巨噬细胞抗原呈递功能活化程度强于CCR2-巨噬细胞。(3)在VMC小鼠,B细胞分泌CCL2、CCL7,增加心肌组织CCL2、CCL7表达水平,促进心肌组织单核细胞浸润,增加心肌CCR2+巨噬细胞浸润,加重心肌损伤。(4)在VMC小鼠,B细胞促进心肌巨噬细胞向M1极化,并且与STAT1信号转导通路有关。