目的:锰（Manganese,Mn）作为人体必需微量元素之一,参与体内多种重要激酶的构成和生物反应,对维持中枢神经系统的正常功能十分重要。然而,长期慢性的Mn暴露可以引发神经系统损伤,神经行为发生异常改变,表现为类帕金森样综合征,即锰中毒。由于锰在工业生产中的广泛使用,职业性Mn暴露已成为引发神经退行性疾病的重要环境致病因素。关于Mn引起的神经毒作用机制研究有很多,包括线粒体损伤,内质网应激,氧化应激损伤,α-突触核蛋白（Alpha-synuclein,α-Syn）寡聚化,自噬功能异常等等。自噬作为机体的降解/再循环系统,参与维持体内蛋白质稳态,调节凋亡。目前有研究发现自噬功能异常与神经退行性变密切相关,因此,在锰诱导的神经毒性过程中,其诱导的α-Syn寡聚化与自噬功能异常之间存在着非常复杂的关系,亟待研究。自噬作为机体的保护性机制,受多种信号通路调节,如mTOR-ULK和Beclin1-PIK3C3。mTOR（Mammalian target of rapamycin）信号通路的抑制与自噬活化有关。Beclin1可以与胞浆内的高迁移率族蛋白1（High-mobility group box 1,HMGB1）蛋白相互作用参与调节自噬。有研究发现α-Syn过表达可以干扰HMGB1与Beclin1之间的相互作用。这些为研究Mn的神经毒作用机制提供新的思路。近年来柯诺辛碱B（Corynoxine B,Cory B）,又称异钩藤碱,是一种中草药提取物,被发现在多种细胞中具有神经保护性作用。而在Mn引起的神经毒性过程中,其作用以及具体机制均亟待阐明。本研究通过整体动物体内实验和体外细胞实验相结合的方法,全面阐述自噬和α-Syn在Mn诱导的神经毒性中的复杂联系。利用野生型C57小鼠(α-Syn^+/+)和α-Syn基因敲除型小鼠(α-Syn^-/-)建立Mn暴露动物模型,研究α-Syn蛋白在锰致细胞自噬信号分子变化中的作用;利用Rapamycin（Rap）和3-methyladenine（3-MA）自噬干预剂,建立Mn暴露野生型小鼠(α-Syn^+/+)动物模型,研究自噬在Mn诱导的α-Syn寡聚化和神经毒性中的作用;利用人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）建立Mn暴露细胞模型,揭示胞浆中HMGB1在Mn诱导自噬活化中的作用以及阐明Cory B调节Mn诱导自噬失调的具体机制。此研究不仅为预防和治疗锰中毒及其他神经退行性疾病提供一定的实验和理论依据,而且在加强锰中毒早期防治和保护锰接触者健康方面有重要的现实意义,也为神经退行性疾病的治疗提供了另一种重要的研究思路。研究方法:1、整体动物体内实验研究α-Syn对锰诱导自噬和神经细胞损伤的影响:从美国Jackson Labs引进了α-Syn基因敲除的纯合子雄性小鼠（B6;129X-SncatmlRosl,stock#3692）,并与国内雌性小鼠（C57/Bl6J）建立了稳定的α-Syn基因敲除小鼠(α-Syn^-/-)模型。同代随机选取24只雌雄各半野生型小鼠(α-Syn^+/+)和24只雌雄各半α-Syn^-/-小鼠进行以下实验。根据随机化原则将α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠分为对照组和低,中,高剂量染锰组,每组6只（雌性:雄性=1:1）,对照组的α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠腹腔注射生理盐水,低剂量染锰组的α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠腹腔注射50μmol/kg MnCl₂,中剂量染锰组的α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠腹腔注射100μmol/kg MnCl₂,高剂量染锰组的α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠腹腔注射200μmol/kg MnCl₂,每周5次注射容量5 ml/kg,染毒6周,进行相关指标检测。采用旷场实验、强迫游泳实验、双足平衡实验以及爪抓力实验检测小鼠行为学改变,采用原子吸收分光光度火焰法测定纹状体Mn含量,流式细胞仪检测细胞凋亡以及自噬发生情况,透射电子显微镜技术观察神经细胞内自噬体的超微结构变化,激光共聚焦显微镜观察Lamp 2A和HSC70、Lamp 2A和α-Syn的共定位情况,免疫共沉淀检测Lamp 2A和HSC70、Lamp 2A和α-Syn蛋白间的相互作用,采用Real time PCR法检测Lamp 2A、HSC70和α-Syn mRNA水平,非变性Western blot方法检测α-Syn单体及寡聚体,Western blot法检测Lamp 2A、HSC70、Beclin1、LC3B、p62蛋白水平。2、整体动物体内实验研究自噬对锰诱导α-Syn寡聚化和神经细胞损伤的影响:由中国医科大学实验动物中心提供的36只雌雄各半野生型（C57/Bl6）小鼠进行以下实验。随机分为6组:对照组,高剂量染锰组,Rap对照组,Rap干预组,3-MA对照组,3-MA干预组,每组6只（雌性:雄性=1:1）。对照组腹腔注射生理盐水,高剂量染锰组腹腔注射200μmol/kg MnCl₂,Rap对照组隔日1次皮下注射5 mg/kg Rap,2 h后再给予腹腔注射生理盐水,Rap预处理组隔日1次皮下注射5 mg/kg Rap,2 h后再给予腹腔注射200μmol/kg MnCl₂,3-MA对照组隔日1次皮下注射5 mg/kg3-MA,2 h后再给予腹腔注射生理盐水,3-MA干预组隔日1次皮下注射5 mg/kg3-MA,2 h后再给予腹腔注射200μmol/kg MnCl₂,每周5次,连续预处理与染毒6周,进行相关指标检测。采用旷场实验、强迫游泳实验、双足平衡实验以及爪抓力实验检测小鼠行为学改变,采用原子吸收分光光度火焰法测定纹状体Mn含量,流式细胞仪检测细胞凋亡以及自噬发生情况,采用Real time PCR法检测α-Syn mRNA水平,非变形Western blot方法检测α-Syn单体及寡聚体,Western blot法检测Beclin1、LC3B、p62蛋白水平。3、体外人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）培养研究Cory B缓解锰诱导SH-SY5Y细胞自噬功能异常和细胞损伤的潜在保护性分子机制:将细胞分别设立对照组（培养基）、不同剂量的染锰组（50、100、200μM）、Cory B阳性对照组以及不同剂量的Cory B干预组（25、50、100μM）。染毒24 h后,收集细胞进行相关指标的检测。采用商品化试剂盒检测LDH释放量和CCK-8水平,利用商品化试剂盒提取胞浆胞核蛋白,激光共聚焦显微镜观察HMGB1亚细胞定位以及HMGB1与Beclin1、HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2的共定位情况,免疫共沉淀技术检测胞浆内蛋白间相互作用（HMGB1-Beclin1、HMGB1-α-Syn、Beclin1-Bcl2）,Real time PCR检测HMGB1 mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和自噬发生水平,MDC染色观察自噬囊泡,Ad-mCherry-CFP-LC3B腺病毒转染观察自噬流,Western blot法检测胞浆胞核HMGB1、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3II/I、p62）、α-Syn、Bcl2、mTOR下游相关蛋白（mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、S6K1、p-S6K1）。结果:1、染锰6周可以引起α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠行为发生异常改变。与对照组比较,随着染毒剂量增加,总移动距离以及站立次数逐渐减少,悬浮时间、爪抓力逐渐增加,双足平衡越来越差。与染锰组α-Syn^+/+小鼠比较,染锰组α-Syn^-/-小鼠神经行为损伤更为严重;纹状体锰含量对染锰剂量增高而增多,凋亡和自噬水平（电镜观察自噬体形成增多、流式细胞术检测自噬囊泡水平升高）均高于对照组,且染锰组α-Syn^-/-小鼠表现更为剧烈相比于α-Syn^+/+小鼠;锰暴露上调α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠神经细胞内Lamp 2A、HSC70 mRNA和蛋白表达水平,以及增强二者的共定位和蛋白间相互作用,即活化分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophay,CMA）;在α-Syn^+/+小鼠中,锰暴露使α-Syn mRNA和蛋白表达水平增加,使Lamp 2A与α-Syn之间的共定位和相互作用均增强;锰暴露使α-Syn^-/-和α-Syn^+/+小鼠神经细胞内Beclin1、LC3II/I蛋白表达增多,p62蛋白表达下降,与染锰组α-Syn^+/+小鼠比较,α-Syn^-/-小鼠LC3II/I蛋白表达显著增多。2、染锰6周后,200μmol/kg染锰组、Rap、3-MA干预组小鼠行为发生异常改变,与对照组比较,总移动距离和站立次数均明显下降,悬浮时间、爪抓力以及双后肢重力差值均显著增加,Rap、3-MA对照组未见明显改变;200μmol/kg染锰组、Rap、3-MA干预组小鼠纹状体锰含量均显著高于对照组,Rap、3-MA对照组未见纹状体锰含量增多;与对照组比较,200μmol/kg染锰组神经细胞凋亡和自噬水平（流式细胞术检测自噬囊泡水平升高、Beclin1和LC3II/I蛋白表达增多,p62蛋白表达下降）均显著升高,α-Syn mRNA和寡聚化水平均显著增加,Rap、3-MA对照组凋亡以及α-Syn mRNA和蛋白水平均未见明显改变,Rap对照组LC3II/I蛋白表达显著增多且伴有p62下降,3-MA对照组p62蛋白表达增多,流式细胞术分析自噬囊泡水平未见明显改变;与200μmol/kg染锰组比较,Rap干预后可以缓解凋亡,增强自噬,促进α-Syn单体和寡聚体蛋白水平降解。而3-MA干预后表现为凋亡加剧,抑制自噬,α-Syn寡聚体进一步蓄积。3、Mn诱导的α-Syn过表达影响SH-SY5Y胞浆内HMGB1调控的自噬活化,随着染锰剂量增加,HMGB1 mRNA水平上升且逐渐转位至胞浆内,胞浆HMGB1、α-Syn、Bcl2蛋白表达水平升高,胞浆内的HMGB1与Beclin1、HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合增多,自噬增强,凋亡加剧;与100μM染锰组比较,200μM染Mn组α-Syn蛋白表达显著增多,自噬减弱,胞浆内的HMGB1与Beclin1结合显著减少,而HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合显著增多。Cory B通过解离胞浆内的HMGB1与α-Syn的结合以及抑制mTOR信号通路来调节Mn诱导SH-SY5Y的自噬功能异常和神经毒性,与200μM染Mn组比较,100μM Cory B干预可以明显缓解Mn引起的细胞损伤以及凋亡情况,促进自噬,α-Syn、Bcl2蛋白表达水平未见改变,胞浆内的HMGB1与Beclin1结合显著增多,而HMGB1与α-Syn、Beclin1与Bcl2结合显著减少。此外,Cory B干预组可以进一步使p-mTOR/t-mTOR、p-4EBP1/t-4EBP1、p-S6K1/t-S6K1蛋白表达相对灰度值下降,有效抑制mTOR信号通路活化。结论:1、锰活化CMA与α-Syn无关,活化的CMA参与锰诱导的α-Syn过表达的降解。2、锰活化巨自噬,且α-Syn^-/-小鼠自噬和凋亡更剧烈,行为损伤更明显。3、Rap活化自噬促进锰诱导的α-Syn寡聚体清除可以缓解锰引起的凋亡,3-MA则反之。4、Mn暴露使神经细胞内过多的α-Syn与HMGB1结合,干扰HMGB1蛋白的转位及与Beclin1的结合,影响Beclin1-Bcl-2复合物的解离,引起自噬功能异常和凋亡加重。5、Cory B通过减弱α-Syn与HMGB1蛋白相互作用以及有效抑制mTOR信号通路,缓解锰对神经细胞的毒性作用。