论文部分内容阅读
一、沉默自噬相关基因ATG5对鼻咽癌CNE-1及CNE-2细胞放射敏感性的影响[目的]通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默自噬相关基因ATG5(autophagy-related gene 5,ATG5),并观察ATG5沉默对鼻咽癌CNE-1 及CNE-2细胞受到电离辐射后增殖能力、凋亡情况及DNA双链断裂情况的影响,以探讨自噬对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。[方法]使用经慢病毒包装的自噬相关基因ATG5siRNA表达载体转染鼻咽癌CNE-1及CNE-2细胞,用Real-time PCR及Western-blot实验验证干扰效果。并用CCK-8实验检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞凋亡、Western blot检测各组细胞中DNA双链断裂的标志物磷酸化组蛋白(丫-histone family 2A variant,γ-H2AX)的水平,进而初步验证自噬相关基因ATG5沉默对鼻咽癌CNE细胞放射敏感性的影响。[结果]Real-time PCR和Western-Blot实验结果显示,与阴性对照SCR-shRNA(scrambledhairpin,SCR))组及未转染的 Control 组相比,ATG5沉默组无论是在mRNA水平(P<0.01)还是在蛋白水平,ATG5的表达水平均显著降低。CCK-8实验结果显示,与SCR-shRNA组及Control组相比,ATG5沉默组的CNE细胞存活率均明显降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,经射线照射后,ATG5沉默组的细胞调亡率明显高于Control组及SCR-shRNA组(P<0.05)。Westernblot检测结果显示,经电离辐射后,各组的γ-H2AX蛋白表达水平均出现升高,且ATG5沉默组的γ-H2AX蛋白水平明显高于Control 组及 SCR-shRNA 组。[结论]慢病毒介导的RNA干扰可有效抑制自噬相关基因ATG5的表达,抑制自噬可以增强鼻咽癌CNE细胞的放射敏感性。二、抑制自噬增加鼻咽癌CNE-1及CNE-2细胞放射敏感性的机制研究[目的]通过检测抑制自噬后CNE细胞的细胞周期时相的分布情况及DNA损伤后同源重组修复中起关键作用的RAD51的mRNA表达水平,了解抑制自噬对鼻咽癌细胞细胞周期及RAD51表达水平的影响;并分析不同的RAD51表达水平对鼻咽癌细胞照射后增殖能力的影响,探索抑制自噬影响鼻咽癌CNE细胞放射敏感性的可能机制。[方法]采用流式细胞仪分析细胞群中各细胞周期时相的组成,Real-time PCR实验检测RAD51的mRNA表达水平,CCK-8实验检测电离辐射后各组细胞的细胞活力。其中自噬抑制剂处理组细胞于照射前2小时接受CQ或3-MA预处理,RAD51抑制剂处理组细胞于照射前1h使用B02或RI-1预处理,Flag-RAD51表达载体转染组细胞于照射前48h接受脂质体介导的DNA转染法转染。[结果]流式细胞术检测结果显示,CNE-1细胞的Control组、SCR-shRNA组、ATG5-shRNA1组及ATG5-shRNA2组的细胞周期时相均无明显差异;而CNE-2细胞的ATG5-shRNA1组及ATG5-shRNA2组的G2/M期细胞的百分率低于SCR-shRNA组及Control组(P<0.05),G1期细胞的百分率则高于SCR-shRNA组及 Control 组(P<0.05)。CNE-1 及 CNE-2 细胞的 Real-time PCR 实验结果均显示,电离辐射处理后,SCR-shRNA组及Control组的RAD51的mRNA表达水平较前明显升高(P<0.01)。而不管CNE细胞接受电离辐射与否,ATG5-shRNA1 组及 ATG5-shRNA2 组的 RAD51 的mRNA水平均明显低于Control组及SCR-shRNA组(P<0.05),且在受到电离辐射的细胞中降低的效应更明显(P<0.01)。使用自噬抑制剂CQ或3-MA处理的实验均得到了与ATG5沉默抑制自噬同样的结果(P<0.01)。CNE-1及CNE-2细胞的CCK-8实验结果均显示,经照射处理后,SCR-shRNA组的细胞活力明显高于ATG5-shRNA1组(P<0.01)、ATG5-shRNA2 组(P<0.01)及经 RAD51 抑制剂处理的SCR-shRNA+B02 组(P<0.01)、SCR-shRNA1RI-1 组(P<0.01);而 SCR-shRNA+B02组、ATG5-shRNA1+B02 组、ATG5-shRNA2+B02 组之间及 SCR-shRNA+RI-1 组、ATG5-shRNA1+RI-1组、ATG5-shRNA2+RI-1组之间细胞活力无明显差异;然而,恢复了 RAD51 表达的 Flag-RAD51+ATG5-shRNA1 组及Flag-RAD51+ATG5-shRNA2组的细胞活力明显高于低表达RAD51的ATG5-shRNA1 组及 ATG5-shRNA2 组(P<0.01),而与 SCR-shRNA 组比较差异无统计学意义。[结论]抑制自噬并未能加快鼻咽癌CNE细胞的细胞周期时相,而是通过降低同源重组修复的关键蛋白RAD51的表达水平,增加受照射细胞的损伤,从而增强鼻咽癌细胞的放射敏感性。