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[目的]鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)为鸟苷酸结合蛋白家族成员,干扰素、白介素、TNF-α等多种细胞因子可诱导内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等产生GBP1,参与机体抵抗病原微生物感染、免疫调节等多种生物学过程,在消化系统肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺癌、骨髓瘤和胶质瘤等肿瘤的生长、侵袭、转移等过程起重要作用,但作用机制不尽相同。我们的前期研究发现,GBP1可促进人脑胶质瘤细胞在裸小鼠体内的增殖,但在体外的增殖未见明显变化,这可能与肿瘤微环境有关。本研究旨在探讨MDSCs在GBP1促进胶质瘤增殖中的作用。[方法]1.课题组前期构建过表达GBP1的U87胶质瘤细胞(U87-GBP1)和对照细胞为U87-LacZ,采用qRT-PCR、Western blot方法测定细胞中GBP1的表达,CCK8和致瘤实验验证细胞在体内外生长变化。2.收集人外周血分离外周血单个核细胞(PBMCs),通过免疫磁珠分离其中的CD14+单核细胞和CD3+T细胞。3.用抗人CD3抗体和CD28抗体对分离的CD3+T细胞进行活化,再用荧光染色羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)对活化的T细胞进行染色。4.培养U87-GBP1和U87-LacZ细胞,收集细胞培养液培养CD14+单核细胞48 hr,流式细胞仪分析细胞中CD33+HLA-DR-细胞(髓源性抑制细胞,MDSCs)的比例;将细胞与CFSE染色后的活化T细胞进行共培养,通过分析T细胞中CFSE衰减变化,计算T细胞增殖抑制率。5.qRT-PCR 和 ELISA 方法检测U87-GBP1 和 U87-LacZ 细胞中 CCL2 mRNA 表达及培养液中CCL2蛋白表达。在细胞培养液中加入125 mg/L抗人趋化因子(CC模式)配体2(CCL2)抗体继续培养48 hr,再收集细胞培养液培养CD14+单核细胞,流式细胞仪分析细胞中MDSCs的比例。6.分别将5*106个U87-GBP1和U87-LacZ细胞接种于BalB/C裸小鼠颅内,7 d后将小鼠分别分成两组,其中一组腹腔注射CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2,CCR2)抑制剂RS 504393(2 mg/kg体重/只),另一组注射相等量的DMSO。30 d处死小鼠后分离移植瘤组织和脾脏组织测量大小,并分析组织中小鼠CD11b+Gr-1+细胞(MDSCs)的比例。7.收集人21例胶质瘤患者和19例对照组人员(实验室检查指标正常的体检人员)的外周血2 mL,溶血素裂解红细胞,加入抗人CD33和HLA-DR抗体进行标记,流式细胞仪检测细胞中MDSCs比例。[结果]1.与对照细胞U87-LacZ相比,U87-GBP1细胞中GBP1的mRNA和蛋白表达都明显升高。U87-GBP1细胞在小鼠体内增殖明显快于U87-LacZ细胞,移植瘤重量大于U87-LacZ细胞,但两种细胞在体外增殖未见明显变化。2.用U87-GBP1和U87-LacZ细胞培养液培养CD14+单核细胞,两组细胞中MDSCs 比例都分别高于未处理组,而且U87-GBP1细胞培养液处理组中MDSCs的比例又高于U87-LacZ组(P<0.01)。培养液诱导产生的MDSCs对活化T细胞的增殖产生抑制,U87-GBP1组的抑制率更高(P<0.05)。3.U87-GBP1细胞中及培养液中CCL2 mRNA及蛋白水平都明显高于U87-LacZ细胞。在细胞培养液中加入抗人CCL2抗体中和CCL2,再收集培养液培养CD14+单核细胞,经流式细胞仪分析显示细胞中MDSCs的比例都明显下降(P<0.01),U87-GBP1组降低更多。4.U87-GBP1和U87-LacZ细胞在裸小鼠颅内都可致瘤,U87-GBP1组移植瘤体积大于U87-LacZ组。通过腹腔注射RS 504393治疗小鼠后,肿瘤生长都明显减缓,移植瘤体积小于未治疗组。U87-GBP1组移植瘤和脾脏中MDSCs 比例明显高于U87-LacZ组,用RS 504393治疗后则显著降低,但U87-LacZ组治疗前后未见明显变化。5.胶质瘤患者外周血中MDSCs比例高于对照组人员。[结论]1.胶质瘤细胞培养液可诱导正常人CD14+单核细胞发生转化,成为MDSCs,并对活化T细胞增殖具抑制作用,而GBP1可增强对CD14+单核细胞的转化作用。2.GBP1促进胶质瘤细胞中高表达CCL2。采用抗人CCL2抗体中和细胞培养液中的CCL2,可抑制胶质瘤细胞诱导CD14+单核细胞转化为MDSCs。3.CCR2抑制剂RS 504393可阻断CCL2与其受体CCR2结合,降低MDSCs在胶质瘤中的聚集,减缓细胞在小鼠体内的增殖。提示,GBP1可能通过促进CCL2表达招募MDSCs在肿瘤微环境中聚集,进而促进肿瘤的增殖。