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旋毛虫能够感染包括人类在内的各种食肉动物和杂食动物,可能引起全球的公共卫生健康风险。为确保肉类安全,全球对食用动物中旋毛虫的可靠诊断和控制方法的要求不断提高。旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞（IEC）这一过程是其发育和感染的关键,一些蛋白水解酶可能帮助旋毛虫侵入,而研究与其相关的蛋白酶类对研究抗旋毛虫感染的疫苗至关重要。半胱氨酸蛋白酶在寄生虫免疫逃避、毒力、组织和细胞入侵以及寄生线虫蜕皮等过程中起着关键作用。本文研究的旋毛虫组织蛋白酶L（Ts CL,Gen Bank:XM＿003375022.1）,是本课题组前期从旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）中筛选出的蜕皮相关蛋白酶,是木瓜蛋白酶类型的半胱氨酸蛋白酶,属于C1家族。本文对Ts CL进行了克隆表达并制备了重组的旋毛虫组织蛋白酶L（rTsCL）。应用Western blot和免疫荧光试验（IFA）分析其在不同虫期的表达与定位情况。通过Western blot、ELISA、RNAi以及体内外实验,验证了Ts CL在旋毛虫侵入肠上皮过程的作用。材料与方法1.寄生虫虫种、实验动物、菌株及细胞本实验所用旋毛虫虫种是本实验室昆明鼠保种的河南南阳猪源旋毛虫T1（ISS534）。实验动物为从河南省实验动物中心购得的KM鼠。克隆与表达菌株为BL21。小鼠小肠上皮细胞（IEC）为本实验室稳定保存的。2.Ts CL的生物信息学分析及原核表达应用NCBI、Signal P、SMART等在线网址分析Ts CL基本理化性质。应用Bio Edit软件将旋毛虫Ts CL与其他物种的组织蛋白酶L进行序列比对,构建进化树。应用PCR技术扩增出Ts CL基因,构建重组表达质粒p QE-80L/Ts CL,利用含His标签的镍柱纯化rTsCL。3.Ts CL在旋毛虫各虫期转录、表达及定位收集各个虫期[肌幼虫（ML）、IIL、成虫（AW）、新生幼虫（NBL）]虫体制备c DNA,应用RT-PCR技术分析Ts CL在各虫期的转录情况。应用Western blot及IFA技术分析Ts CL在各虫期的表达与定位。4.Ts CL在旋毛虫侵入肠上皮细胞中的作用应用Western blot、ELISA及IFA验证Ts CL与IEC的结合情况。应用旋毛虫幼虫体外侵入模型将rTsCL或抗rTsCL免疫血清与IIL幼虫在单层IEC上共孵育2 h,观察幼虫侵入情况。设置BSA无关蛋白对照组,IIL ES阳性蛋白对照组,旋毛虫感染小鼠血清及正常小鼠血清对照组。将与感染血清、抗rTsCL免疫血清和正常血清孵育的500条肌幼虫经口接种小鼠,每组小鼠10只。5天后处死小鼠收集成虫计数,观察不同组别之间成虫数量、长度、生殖力及胚胎发育情况。5.沉默Ts CL基因对旋毛虫入侵IEC的影响设计Ts CL基因的ds RNA引物,应用T7反转录试剂盒制备ds RNA-Ts CL。通过Western blot分析ds RNA-Ts CL作用的最佳浓度及时间。测定沉默Ts CL基因后转录水平及虫体蛋白中天然Ts CL酶活性的变化。将干扰后的IIL加入单层IEC上共孵育2 h,观察沉默Ts CL基因后IIL的侵入情况。设置绿色荧光蛋白（GFP）与PBS对照组。6.沉默Ts CL基因对旋毛虫幼虫发育及雌虫生殖力的影响将30只小鼠平均分为3组,分别接种经ds RNA-Ts CL,GFP和PBS处理的ML,每只小鼠接种500条虫。5天后处死小鼠回收小肠内的成虫。计数回收的AW数量并测量长度。培养雌虫,3天后观察雌虫的生殖力。7.统计分析本研究所用数据应用SPSS 21.0软件进行分析。采用单因素方差分析与卡方检验,数据采用均数±标注差,检验水准α=0.05。结果1.Ts CL的生物信息学分析及原核表达Ts CL（Gen Bank:XM＿003375022.1）,基因序列全长1491 bp,编码496 aa,分子量为56.64 k Da,p I为7.81。Ts CL含有信号肽,N端有明显疏水性,含跨膜区（为跨膜蛋白）,亚细胞定位主要在细胞外。该蛋白在24-138 aa处有胱抑素样结构域,196-253aa处有组织蛋白酶前肽抑制剂结构域（I29）,279-494 aa处有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶。有4个活性位点（谷酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺、组氨酸）。以ML c DNA为模板成功扩增出Ts CL基因,构建重组质粒p QE-80L/Ts CL,以IPTG作为诱导剂大量诱导rTsCL并用镍柱纯化。2.Ts CL在各虫期转录及表达及定位RT-PCR结果显示Ts CL在各虫期均转录。Western blot结果显示,抗Ts CL免疫血清能识别各虫期可溶蛋白中的天然Ts CL蛋白。IFA结果显示Ts CL主要定位在旋毛虫的杆状体、肌肉细胞、中肠、表皮和胚胎。3.Ts CL促进了旋毛虫侵入IECWestern blot结果显示,抗rTsCL免疫血清识别IEC蛋白中的10条带（89.5、59.1、55.7、52.0、44.6、41.9、38.4、35.2、32.3、29.9 k Da）,感染血清识别4条带（89.5、52.0、44.6、35.2 k Da）,正常鼠血清不能识别IEC蛋白,表明rTsCL能与IEC蛋白特异性结合,可能与旋毛虫侵入IEC有关。用不同浓度的IEC蛋白包被ELISA板,与不同剂量的rTsCL孵育,结果显示,rTsCL能够与IEC蛋白结合,OD值与IEC蛋白浓度具有相关性（r=0.9243,P<0.01）,与rTsCL浓度也呈相关性（r=0.9059,P<0.01）。IFA结果显示rTsCL能与IEC特异性结合,结合部位主要在细胞质。将不同浓度的rTsCL与IIL幼虫置IEC上共孵育2 h后观察侵入情况,结果显示rTsCL不同剂量（8,12,16μg/m L）组的幼虫侵入率与对照组相比有统计学意义(χ28=4.102,χ212=8.596,χ216=14.286,P<0.01)。3组rTsCL对旋毛虫侵入IEC的促进率分别为21.37%、29.99%、36.72%。BSA对幼虫侵入无促进作用。将不同稀释度的抗rTsCL免疫血清与IIL幼虫置IEC上共孵育2 h后观察侵入情况,结果显示:抗rTsCL免疫血清（1:50,1:100,1:200）组的幼虫侵入率与对照组相比差异有统计学意义(χ21:50=14.566,χ21:100=8.012,χ21:200=5.207,P<0.03),3组抗rTsCL血清对旋毛虫侵入IEC的抑制率分别为40.84%、30.83%、25.72%。感染血清、抗rTsCL免疫血清孵育过的肌幼虫,感染小鼠后5天的肠道成虫数明显降低,2组的成虫荷分别减少了39.88%和25.82%;各组成虫的长度和生殖力的差别无统计学意义（P﹥0.05）。4.沉默Ts CL基因对旋毛虫入侵IEC的影响通过电穿孔法将ds RNA-Ts CL、GFP导入肌幼虫,PBS为对照,培养3天后发现3组虫体死亡率无显著差异（P﹥0.05）。Western blot结果显示,ds RNA-Ts CL浓度为15、30、45、60 ng/μl时,Ts CL蛋白表达水平分别降低了8.67%、22.1%、20.06%及43.5%（P<0.01）;ds RNA-Ts CL浓度为60 ng/μl,分别干扰1、2、3 d时,Ts CL蛋白表达水平分别下降了8.99%、22.28%及53.03%（P<0.01）;ds RNA-Ts CL对Ts CL干扰具有特异性。Real-time PCR结果显示,ds RNA-Ts CL浓度为60 ng/μl,干扰3天时Ts CL基因转录水平降低了26.46%（P<0.01）。Ts CL基因沉默后,旋毛虫ML与IIL虫体蛋白中天然Ts CL酶活性分别降低了34.13%与22.07%（P<0.01）。此外,Ts CL基因沉默后,幼虫对IEC侵入的抑制率为36.58%（F=22.614,P<0.001）。5.沉默Ts CL基因对旋毛虫幼虫发育及雌虫生殖力的影响ds RNA-Ts CL组与PBS组相比回收成虫数减少,减虫率为31.79%（F=32.501,P<0.001）。对成虫的长度进行测量,发现雌虫长度明显变短（F=16.939,P<0.001）,雄虫长度无明显变化。将雌虫培养72 h后发现,ds RNA-Ts CL与PBS相比新生幼虫数量降低（F=182.927,P<0.001）。结论1.克隆表达了重组的旋毛虫组织蛋白酶L（rTsCL）,Ts CL在旋毛虫各虫期均有转录与表达,主要定位在虫体的杆状体、肌肉细胞、中肠、表皮及胚胎。2.rTsCL能特异性地与IEC结合并促进旋毛虫侵入IEC,抗rTsCL免疫血清能抑制旋毛虫侵入IEC。3.RNAi证实Ts CL参与了旋毛虫侵入肠上皮与虫体在肠道内的生长发育。