论文部分内容阅读
【目的】
探讨单胺氧化酶A（MonoamineoxidasesA，MAOA）在人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）-16E7癌蛋白诱导的非小细胞肺癌（Non-smallcelllungcancer,NSCLC）细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducibleFactor-1α,HIF-1α）蛋白堆积中的作用，并初步阐明其分子机制。
【方法】
1.稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA细胞株的建立：利用CRISPR/Cas9技术，设计靶向MAOA基因的小向导RNA(smallguideRNA,sgRNA)序列，将其连接到线性化载体U6-EFS-Cas9-P2A-Puro中构建重组质粒，转化后扩增质粒并挑取单克隆菌落，通过测序验证靶点敲除有效性。将有效靶点质粒包装后感染稳定过表达HPV-16E7的NSCLC细胞（A549和NCI-H460）。感染48h后，用嘌呤霉素（Puromycin,PM）进行筛选并挑取单克隆细胞进行扩大培养，建立稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA的NSCLC细胞。分别用RT-qPCR和Westernblotting检测目的基因和蛋白的表达情况。
以下实验将细胞分为三组：空载体（Emptyvector）对照细胞组（简写为：空载体）、稳定过表达HPV-16E7癌蛋白细胞组（简写为：16E7）和稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA细胞组（简写为：16E7-MAOAKO）。
2.MAOA对NSCLC细胞迁移、EMT及癌症干细胞标志物表达的影响：采用创伤愈合实验分析三组细胞的迁移能力，采用RT-qPCR和Westernblotting分别检测各组细胞中金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases,MMPs）、EMT标志物及癌症干性标志物的表达情况。
3.MAOA对HPV-16E7癌蛋白诱导的HIF-1α蛋白堆积的影响：用MG132抑制不同组（16E7、16E7-MAOAKO组）细胞HIF-1α蛋白的降解，采用Westernblotting分析HIF-1α蛋白的表达情况。
4.采用Westernblotting分析MAOA对HPV-16E7癌蛋白诱导的PI3K/Akt和ERK1/2信号通路激活的影响。
5.动物实验：选取4~6周龄雄性BALB/c裸小鼠，随机分组（每组8只），分别是A549（空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组)；NCI-H460（空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组)。采用以下两种注射方式：
5.1皮下注射：分别吸取各组细胞悬液（2×106个/0.2mL）注射到裸鼠左侧腋下位置，观察裸鼠的生长、饮食情况，并记录皮下肿瘤体积、裸鼠体重变化。4周后，通过腹腔注射过量麻醉药物（5%水合氯醛1mL）处死裸鼠。
5.2肺内原位注射：分别吸取各组细胞悬液（A549细胞系分别注射2×105个/0.05mL，NCI-H460细胞系分别注射5×105个/0.05mL）同Matrigel胶以1∶1的比例混合，混匀后注入小鼠左下肺。当裸鼠体重出现明显下降时，通过腹腔注射过量麻醉药物（5%水合氯醛1mL）处死裸鼠。
取皮下瘤、原位瘤和转移瘤组织，用10%福尔马林固定，通过H&E染色观察细胞形态，采用免疫组织化学分析EMT标志物和HIF-1α的蛋白表达情况。
【结果】
1.RT-qPCR及Westernblotting结果证明成功建立了稳定表达HPV-16E7并敲除MAOA的NSCLC细胞(16E7-MAOAKO)。MAOA敲除后明显抑制了HPV-16E7诱导的MMP-2和MMP-9蛋白的表达，而且逆转了HPV-16E7诱导的EMT相关标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及相关转录因子Slug、Twist1的mRNA和蛋白的表达。
2.敲除MAOA可抑制HPV-16E7诱导的HIF-1α蛋白堆积及其下游VEGF蛋白的表达，而且通过促进26S蛋白酶体降解系统抑制HPV-16E7诱导的HIF-1α蛋白堆积。
3.HPV-16E7癌蛋白促进PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活，敲除MAOA后HPV-16E7癌蛋白诱导的AKT磷酸化不被影响，而HPV-16E7癌蛋白诱导的ERK1/2磷酸化却受到抑制。
4.与空载体组相比，16E7组中癌症干性标志物SOX2、OCT-4、NANOG的蛋白表达升高，敲除MAOA可抑制HPV-16E7癌蛋白诱导的这些癌症干性标志物的蛋白表达。
5.NCI-H460细胞系裸小鼠皮下异种移植肿瘤的成瘤率：空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组的成瘤率分别是100%、100%、75%。与16E7组相比，16E7-MAOAKO组皮下肿瘤的体积和重量明显减小。H&E染色结果显示，16E7组细胞可见胞核着色较深并发生固缩，而16E7-MAOAKO组细胞仅见少量细胞着色较深。免疫组化结果显示，与16E7组相比，16E7-MAOAKO组中MAOA、N-cadherin、Slug、HIF-1α、VEGF、SOX2、OCT-4、NANOG蛋白表达降低，但E-cadherin蛋白表达升高。
6.裸鼠原位注射2W后，NCI-H46016E7组裸小鼠体重开始出现下降，3W后，A54916E7组裸小鼠体重开始出现下降，16E7-MAOAKO组及空载体组体重未见明显改变；解剖后发现，16E7组可见大量癌组织弥漫浸润分布全肺，而16E7-MAOAKO组及空载体组只发现散在的癌结节，肺形态大体正常。空载体组、16E7组及16E7-MAOAKO组均未发现肉眼可见的肝转移。在胸骨组织中，16E7组有明显的胸骨转移并有大量肿瘤细胞的聚集，而空载体组、16E7-MAOAKO组中只有部分裸小鼠发生胸骨转移（A549空载体、16E7、16E7-MAOAKO组胸骨转移率分别为37.5%、100%、25%，NCI-H460空载体、16E7、16E7-MAOAKO组胸骨转移率分别为12.5%、75%、12.5%）。免疫组化结果显示，在肺和肝脏组织中与16E7组相比，16E7-MAOAKO组MAOA、N-cadherin、HIF-1α蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达明显增强。
【结论】
敲除MAOA可抑制HPV-16E7癌蛋白诱导的A549和NCI-H460NSCLC细胞EMT和HIF-1α蛋白的堆积，其机制可能与ERK1/2激活的受抑有关，说明MAOA可能是HPV相关NSCLC防治的潜在靶点。
探讨单胺氧化酶A（MonoamineoxidasesA，MAOA）在人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）-16E7癌蛋白诱导的非小细胞肺癌（Non-smallcelllungcancer,NSCLC）细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducibleFactor-1α,HIF-1α）蛋白堆积中的作用，并初步阐明其分子机制。
【方法】
1.稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA细胞株的建立：利用CRISPR/Cas9技术，设计靶向MAOA基因的小向导RNA(smallguideRNA,sgRNA)序列，将其连接到线性化载体U6-EFS-Cas9-P2A-Puro中构建重组质粒，转化后扩增质粒并挑取单克隆菌落，通过测序验证靶点敲除有效性。将有效靶点质粒包装后感染稳定过表达HPV-16E7的NSCLC细胞（A549和NCI-H460）。感染48h后，用嘌呤霉素（Puromycin,PM）进行筛选并挑取单克隆细胞进行扩大培养，建立稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA的NSCLC细胞。分别用RT-qPCR和Westernblotting检测目的基因和蛋白的表达情况。
以下实验将细胞分为三组：空载体（Emptyvector）对照细胞组（简写为：空载体）、稳定过表达HPV-16E7癌蛋白细胞组（简写为：16E7）和稳定过表达HPV-16E7并敲除MAOA细胞组（简写为：16E7-MAOAKO）。
2.MAOA对NSCLC细胞迁移、EMT及癌症干细胞标志物表达的影响：采用创伤愈合实验分析三组细胞的迁移能力，采用RT-qPCR和Westernblotting分别检测各组细胞中金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases,MMPs）、EMT标志物及癌症干性标志物的表达情况。
3.MAOA对HPV-16E7癌蛋白诱导的HIF-1α蛋白堆积的影响：用MG132抑制不同组（16E7、16E7-MAOAKO组）细胞HIF-1α蛋白的降解，采用Westernblotting分析HIF-1α蛋白的表达情况。
4.采用Westernblotting分析MAOA对HPV-16E7癌蛋白诱导的PI3K/Akt和ERK1/2信号通路激活的影响。
5.动物实验：选取4~6周龄雄性BALB/c裸小鼠，随机分组（每组8只），分别是A549（空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组)；NCI-H460（空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组)。采用以下两种注射方式：
5.1皮下注射：分别吸取各组细胞悬液（2×106个/0.2mL）注射到裸鼠左侧腋下位置，观察裸鼠的生长、饮食情况，并记录皮下肿瘤体积、裸鼠体重变化。4周后，通过腹腔注射过量麻醉药物（5%水合氯醛1mL）处死裸鼠。
5.2肺内原位注射：分别吸取各组细胞悬液（A549细胞系分别注射2×105个/0.05mL，NCI-H460细胞系分别注射5×105个/0.05mL）同Matrigel胶以1∶1的比例混合，混匀后注入小鼠左下肺。当裸鼠体重出现明显下降时，通过腹腔注射过量麻醉药物（5%水合氯醛1mL）处死裸鼠。
取皮下瘤、原位瘤和转移瘤组织，用10%福尔马林固定，通过H&E染色观察细胞形态，采用免疫组织化学分析EMT标志物和HIF-1α的蛋白表达情况。
【结果】
1.RT-qPCR及Westernblotting结果证明成功建立了稳定表达HPV-16E7并敲除MAOA的NSCLC细胞(16E7-MAOAKO)。MAOA敲除后明显抑制了HPV-16E7诱导的MMP-2和MMP-9蛋白的表达，而且逆转了HPV-16E7诱导的EMT相关标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及相关转录因子Slug、Twist1的mRNA和蛋白的表达。
2.敲除MAOA可抑制HPV-16E7诱导的HIF-1α蛋白堆积及其下游VEGF蛋白的表达，而且通过促进26S蛋白酶体降解系统抑制HPV-16E7诱导的HIF-1α蛋白堆积。
3.HPV-16E7癌蛋白促进PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活，敲除MAOA后HPV-16E7癌蛋白诱导的AKT磷酸化不被影响，而HPV-16E7癌蛋白诱导的ERK1/2磷酸化却受到抑制。
4.与空载体组相比，16E7组中癌症干性标志物SOX2、OCT-4、NANOG的蛋白表达升高，敲除MAOA可抑制HPV-16E7癌蛋白诱导的这些癌症干性标志物的蛋白表达。
5.NCI-H460细胞系裸小鼠皮下异种移植肿瘤的成瘤率：空载体组、16E7组、16E7-MAOAKO组的成瘤率分别是100%、100%、75%。与16E7组相比，16E7-MAOAKO组皮下肿瘤的体积和重量明显减小。H&E染色结果显示，16E7组细胞可见胞核着色较深并发生固缩，而16E7-MAOAKO组细胞仅见少量细胞着色较深。免疫组化结果显示，与16E7组相比，16E7-MAOAKO组中MAOA、N-cadherin、Slug、HIF-1α、VEGF、SOX2、OCT-4、NANOG蛋白表达降低，但E-cadherin蛋白表达升高。
6.裸鼠原位注射2W后，NCI-H46016E7组裸小鼠体重开始出现下降，3W后，A54916E7组裸小鼠体重开始出现下降，16E7-MAOAKO组及空载体组体重未见明显改变；解剖后发现，16E7组可见大量癌组织弥漫浸润分布全肺，而16E7-MAOAKO组及空载体组只发现散在的癌结节，肺形态大体正常。空载体组、16E7组及16E7-MAOAKO组均未发现肉眼可见的肝转移。在胸骨组织中，16E7组有明显的胸骨转移并有大量肿瘤细胞的聚集，而空载体组、16E7-MAOAKO组中只有部分裸小鼠发生胸骨转移（A549空载体、16E7、16E7-MAOAKO组胸骨转移率分别为37.5%、100%、25%，NCI-H460空载体、16E7、16E7-MAOAKO组胸骨转移率分别为12.5%、75%、12.5%）。免疫组化结果显示，在肺和肝脏组织中与16E7组相比，16E7-MAOAKO组MAOA、N-cadherin、HIF-1α蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达明显增强。
【结论】
敲除MAOA可抑制HPV-16E7癌蛋白诱导的A549和NCI-H460NSCLC细胞EMT和HIF-1α蛋白的堆积，其机制可能与ERK1/2激活的受抑有关，说明MAOA可能是HPV相关NSCLC防治的潜在靶点。