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目的:对IL-10修饰后的h AMSCs(IL-10-h AMSCs)是否改变h AMSCs的表型、生长特性和多向分化能力的生物学特性进行评价,并就IL-10-h AMSCs局部移植对小鼠皮肤全层缺损创面血管相关因子VEGF、b FGF表达的影响进行检测分析,为IL-10以及IL-10修饰hAMSCs的临床应用提供实验依据。方法:1.采用流式细胞术(FCM)分别对培养的h AMSCs、IL-10修饰的h AMSCs和空质粒转染的h AMSCs进行CD73、CD90、CDl05及CD44表型分子鉴定,MTT法绘制各组h AMSCs生长曲线,并用成骨、成脂诱导培养检测各组h AMSCs的多向分化能力。2.采用细胞培养划痕实验,检测h AMSCs、IL-10-h AMSCs以及空质粒-h AMSCs的迁移能力。3.选择7周龄健康雄性C57BL/6野生小鼠80只,随机分成PBS移植组、h AMSCs移植组、IL-10-h AMSCs移植组、空质粒转染h AMSCs移植组,每组各20只小鼠。麻醉后在小鼠背部两侧各切取1cm×1cm大小的全层皮肤缺损创面模型。根据分组不同,在建模即刻于每个创面周围皮下多点(创缘各边中点距创面1mm处)注射100μl PBS悬浮的不同组别的h AMSCs(细胞总数为1×106个),PBS移植组注射等量PBS。4.建模后1d、3d、7d、14d,分别处死各组损伤小鼠5只,沿创缘切取创面全层组织。HE染色观察创面组织中炎性细胞浸润及新生血管情况。ELISA检测小鼠创面组织匀浆中VEGF、b FGF的表达。免疫荧光染色观察各组小鼠背部全层皮肤缺损创面组织中VEGF、b FGF的表达情况。结果:1.经流式细胞仪检测结果表明,h AMSCs高表达CD73(99.85%)、CD90(90.55%)、CDl05(97.95%)及CD44(99.57%),IL-10-h AMSCs高表达CD73(98.6%)、CD90(93.8%)、CD105(99.8%)及CD44(97.7%),空质粒-h AMSCs高表达CD73(94.1%)、CD90(98.1%)、CD105(96.6%)及CD44(94.8%),三者均不表达CD34、CD45、CDl1b、CDl9、HLA-DR。表型符合国际细胞治疗协会就间充质干细胞表面标志的规定。各组细胞生长曲线呈“S”形。IL-10转染后的h AMSCs增殖能力较未转染的h AMSCs以及空质粒转染的h AMSCs有所下降。生长曲线显示第3代IL-10-h AMSCs细胞生长曲线呈“S”形。细胞培养到21d时,行成骨诱导的茜素红S染色,可见红色钙化结节,行成脂诱导的油红O染色,红色显示在脂滴处,IL-10-h AMSCs与h AMSCs、空质粒-h AMSCs诱导能力无明显差别。2.划痕实验结果显示,IL-10-h AMSCs细胞在0h与h AMSCs组、空质粒组迁移能力基本一致,6h、12h、18h的IL-10-h AMSCs组细胞向空白区域迁移能力稍大于h AMSCs组、空质粒组,表明IL-10可以增强hAMSc的迁移能力。3.HE结果显示:在显微镜下观察,各组小鼠创面组织第1d均有大量炎性细胞浸润,可见坏死组织;第3d时各组创面组织炎性细胞浸润较第1d减少,出现大量新生毛细血管,成纤维细胞逐渐出现,其中h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组及空质粒组小鼠创面组织炎性细胞浸润较PBS组少,成纤维细胞数量以及新生毛细血管生成数量较PBS组多,其中以IL-10-h AMSCs组最优,典型新鲜肉芽组织形成;第7d时各组创面组织炎性细胞浸润较第3d明显减少,成纤维细胞成熟,数量较第3d增加,毛细血管数量较第3d减少,其中IL-10-h AMSCs组成纤维细胞数量较其余三组少,以PBS组最多;第14d时各组小鼠创面未见明显炎性细胞,毛细血管数量较第7d减少,成纤维细胞数量较第7d多,其中IL-10-h AMSCs组成纤维细胞数量较其余三组少,PBS组最多。4.ELISA法检测各组标本全层皮肤缺损模型组织中VEGF及b FGF含量,在建模后第1d、3d、7d、14d,PBS组VEGF含量分别为:96.78±4.87、100.84±4.69、103.08±4.21、99.70±5.05ng/L;h AMSCs组VEGF含量分别为:101.77±4.05、115.2±4.03、117.48±6.1、112.61±2.23ng/L;IL-10-h AMSCs组VEGF含量分别为:132.71±3.09、136.86±4.75、142.17±7.39、138.93±5.84ng/L;空质粒组VEGF含量分别为:105.31±4.70、111.89±4.41、115.02±6.96、110.79±3.97ng/L。PBS组b FGF含量分别为:8.78±0.70、11.61±0.22、13.11±0.36、11.20±0.49ng/L;h AMSCs组b FGF含量分别为:9.90±0.44、15.73±1.43、19.50±1.11、16.20±1.96ng/L;IL-10-h AMSCs组bFGF含量分别为:16.70±1.78、21.73±1.85、23.13±1.67、22.19±1.55ng/L;空质粒组b FGF含量分别为:9.10±0.64、15.93±1.51、18.90±1.49、16.40±1.66ng/L。各组VEGF、b FGF含量第1d、第3d、第7d逐渐增加,第14d含量较第7d有所下降,h AMSCs组、IL-10-h AMSCs组和空质粒组较PBS组在第1d、第3d、第7d的VEGF、b FGF含量明显增高,且IL-10-h AMSCs组升高更明显,差异具有统计学意义(P<0.05),hAMSCs组和空质粒组未见明显差异。5.免疫荧光染色观察各组标本创面组织中VEGF与b FGF表达情况,在建模后第1d、3d、7d、14d,PBS组VEGF阳性率分别为:33.24±0.85、35.65±1.75、38.57±1.32、34.94±1.25;h AMSCs组VEGF阳性率分别为:37.25±1.05、42.87±0.79、48.92±1.46、43.93±1.68;IL-10-h AMSCs组VEGF阳性率分别为:54.57±1.38、67.10±0.94、71.11±1.53、68.35±1.09;空质粒组VEGF阳性率分别为:35.29±0.57、41.34±0.95、48.22±1.44、43.61±1.56。PBS组b FGF阳性率分别为:16.99±1.04、22.00±0.46、25.97±0.70、21.85±1.15;h AMSCs组b FGF阳性率分别为:20.13±1.06、26.20±1.15、31.17±1.21、28.18±0.76;IL-10-h AMSCs组b FGF阳性率分别为:26.41±0.86、34.42±1.85、38.57±1.33、33.97±0.38;空质粒组b FGF阳性率分别为:19.23±1.02、25.16±1.11、30.27±0.93、27.22±1.17。结果见自第1d、第3d、第7d,VEGF及b FGF阳性率逐渐增加,第14d阳性表达较第7d稍降低,IL-10-h AMSCs组、h AMSCs组及空质粒组阳性率在各时间点均高于PBS组,其中IL-10-h AMSCs组阳性表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)采用慢病毒载体搭载IL-10基因修饰后的h AMSCs除细胞增殖能力受到一定程度的抑制外,不影响h AMSCs的表型特征和多向分化能力的基本生物学特性;(2)IL-10可增强h AMSCs的迁移能力,移植IL-10-h AMSCs能够上调创面组织VEGF以及b FGF的表达,促进血管再生,并促进创面愈合。