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目的：牙周病是危害口腔健康的两大类疾病之一,在全世界范围内均有较高的发病率,尤其是在我国,是造成成年人牙齿丧失的主要原因之一。牙周病是发生在牙支持组织的一种慢性感染性疾病,其中一个最重要的病理变化就是牙槽骨的吸收。如何使丧失的牙周支持组织再生已成为牙周组织工程领域研究的一个热点问题。特殊富含AT序列结合蛋白(special AT-rich sequence binding protein,SATB)-2是一种核基质蛋白,在颅面部的发育和成骨细胞的分化中起关键性作用。研究发现satb2可以与核基质结合区(matrix-attachment region, MAR)(?)结合并以MAR依赖的方式激活多种基因转录过程,说明Satb2是一个强有力的骨诱导分子可以招募其他的转录因子,形成一个平台或是转录网络中的一个交叉点分子,直接或间接地调控主要的骨基因的表达。最近研究发现satb2在牙胚中表达,说明satb2在牙及牙周组织发育中起一定的作用。核心结合因子α1(core binding factor α1, cbfα1)是成骨特异性转录因子和成骨细胞分化的关键因子,cbfα1-/-基因敲除小鼠表现为完全骨组织丧失和牙胚发育阻滞,表明cbfα1对于骨诱导及牙周组织的发育是必不可少的。cbfα1可以通过和多种骨特异性基因中的顺式作用元件2(OSE2)结合来刺激成骨特异性基因的表达。骨的形成本身就是一个复杂的过程,要受多种转录因子和骨形成基因的调控。因此我们设想将两个通过不同途径对骨形成和成骨细胞分化起调节作用的转录因子联合起来,研究其对目的细胞生物学特性影响,将为我们进一步研究这两个基因在牙周组织再生中的作用奠定基础。人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts HGFs)具有取材丰富,容易培养等优点,并且能在某些因子的诱导下具有一定成骨特性,因此我们将人牙龈成纤维细胞作为本研究的目的细胞。然而所构建的satb2、cbfα1及其共表达载体能否成功感染目的细胞,并对目的细胞的生物学特性是否产生影响,尚不清楚。因此本实验的目的是建立人牙龈成纤维细胞体外培养模型；构建satb2、cbfα1共表达及分别表达的慢病毒载体(Lentivirus vector,LVs) Plenti6.3-cbfal-IRES-satb2(pL-cs)、Plenti6.3-cbfal-IRES-EGFP (pL-c)、Plenti6.3-satb2-IRES-EGFP(pL-s)；探讨慢病毒载体介导的satb2、cbfα1基因感染人牙龈成纤维细胞的可能性,并比较这两个基因感染后对牙龈成纤维细胞生物学特性的影响,为进一步研究这2个基因在牙周组织再生中的作用奠定基础。方法：1、采用组织块法分离、培养人牙龈成纤维细胞,采用MTT检测正常HGFs增殖情况,采用RT-PCR及western blot(?)测HGFs中satb2、cbfα1mRNA和蛋白表达；2、构建携带satb2和cbfal基因全长的慢病毒载体Plenti6.3-cbfα1-IRES-satb2(pL-cs)、Plenti6.3-cbfα1-IRES-EGFP (pL-c)、Plenti6.3-satb2-IRES-EGFP (pL-s),通过酶切、测序鉴定所构建的载体；转染293T细胞、包装、收集、浓缩慢病毒颗粒,测定病毒滴度；用所包装的慢病毒感染HGFs,通过荧光显微镜观察外源基因satb2和cbfα1感染HGFs情况、采用荧光实时定量PCR、免疫细胞化学染色分别检测其mRNA、蛋白的表达；3、采用MTT法评价pL-cs、pL-c、pL-s感染后对HGFs增殖的影响；采用荧光实时定量PCR检测pL-c、pL-s感染HGFs后成骨特异性基因OPN、BSP、 OC、Coll mRNA的表达。结果：1、原代培养的HGFs呈贴壁式生长,形状呈长梭形,多边形,细胞前两天生长缓慢,其后细胞增殖加快,第五天达到平台期；正常HGFs中可以检测到satb2mRNA及蛋白的表达,但cbfα1仅检测到mRNA的表达。2、通过酶切、测序鉴定,成功构建慢病毒pL-cs、pL-c、pL-s;经过包装、收集、浓缩细胞上清液获得慢病毒颗粒,检测各慢病毒滴度均达107TU/ml以上；所获得的慢病毒能够成功感染HGFs,经荧光实时定量PCR检测发现pL-cs感染组外源基因satb2、cbfα1mRNA表达量分别增加了3.9和7.1倍(P<0.05),pL-c感染组cbfα1表达量增加了7.4倍(P<0.05),pL-s感染组satb2表达量增加了3.7倍(P<0.05)；经免疫细胞化学染色,发现过表达satb2的细胞呈强阳性染色,而未感染和感染空载体的细胞呈弱阳性或阳性,过表达cbfα1的细胞呈阳性染色,而未感染和感染空载体的细胞呈阴性。3、慢病毒pL-cs、pL-c、pL-s感染的HGFs其增殖速度比感染空白载体组和未感染的正常对照组的略慢(P<0.05),但pL-c、pL-s、pL-cs感染组之间细胞增殖并无明显差异(P>0.05)；感染satb2和cbfα1的HGFs成骨相关基因OPN、BSP、OC、ColI表达较感染空白载体和未感染的正常对照组均增高(P<0.05),satb2组的牙龈成纤维细胞成骨相关基因BSP、OPN表达量低于cbfα1组(P<0.01),但Coll表达明显高于cbfα1组(P<0.01),而OC的表达在satb2组和cbfα1组之问没有显著差异(P>0.05)结论：1、采用组织块法成功构建体外培养人牙龈成纤维细胞的模型,其方法具有操作简便,成活率高的优点。2、用慢病毒表达体系,成功构建了分别携带cbfα1、satb2及共表达慢病毒载体,并且所获得的慢病毒能够成功感染人牙龈成纤维细胞。3、慢病毒表达体系对细胞的生长无明显影响,但若携带大片段基因就有可能对细胞的增殖产生一定的影响。人牙龈成纤维细胞在cbfα1、satb2的诱导下有向成骨细胞分化的潜力,cbfα1比satb2更能直接促进人牙龈成纤维细胞成骨相关基因BSP、OPN的表达。