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人组织激肽释放酶结合蛋白（Kallistatin,Kal）,作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,在炎症反应、血管生成以及损伤修复等多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。本实验室前期研究表明,Kal具有良好的抗肝纤维化的作用,可以抑制大鼠肝星状细胞的活化,下调星状细胞中的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,并且抑制H202诱导的星状细胞活性氧的形成。目前,学界一致认为星状细胞是肝纤维化的主要效应细胞。但是,作为肝非实质细胞中数量最多的一类细胞,肝血窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cells,HSEC）的表型以及生理特性的改变,也会导致肝脏微循环发生改变,引起肝窦毛细血管化,而这一改变是肝纤维化形成的重要病理学指标。近期有研究表明,采用靶向血管生成分子通路的药物干预,也引起肝纤维化程度减轻,说明新生血管形成确实可能是抑制肝纤维化发生的重要靶点,为肝纤维化的治疗提供了新的研究方向与思路。因此,本文旨在探讨Kal是否也能够通过作用于HSEC,发挥抗肝纤维化作用。肝窦是肝内一个独特的微血管系统,其血管由窗孔化的、没有基底膜包围的HSEC构成。NO信号通路是维持正常HSEC窗孔结构的重要信号通路。NO来源于两方面:一是肝细胞或肝星状细胞受到刺激后旁分泌而来;另一个是由HSEC的eNOS自分泌而来。本文采用体外HSEC模型探究Kal对于HSEC窗孔结构的影响,以及其分子机制。本文采用实验室保存的重组人组织激肽释放酶结合蛋白（rhKal）毕赤酵母工程菌,在7.5升培养罐内高密度发酵,经过分离、纯化得到rhKal。经Elisa定量测定,平均每罐可以获得70mg的rhKal。经SDS-PAGE及Western Blot分析,纯化后的rhKal蛋白纯度能达到95%以上,分子量在40 kD左右。本文采用胶原酶原位灌注、Percoll密度离心、选择性细胞贴壁方法,来进行大鼠HSEC的分离。所得到的HSEC在光镜下呈典型的纺锤状细胞形态,在扫描电镜下可观察到窗孔结构。通过免疫细胞化学染色方法鉴定HSEC纯度,92%的细胞为CD31、CD34、CD14染色阳性,CD45染色阴性,剩余细胞主要为枯否细胞,可以进行后续实验。HSEC的得率为（1.78±0.33）×107/只大鼠,细胞活力≥95%。体外摄取DiI-Ac-LDL实验说明,分离所得的HSEC具有良好的生物活性。在HSEC体外实验中,首先考察了rhKal对HSEC窗孔的维持作用。实验结果表明,体外培养48h后,HSEC的窗孔密度降低38%左右,而加入rhKal后,HSEC的窗孔密度仅降低15%,体外培养72h后,HSEC细胞的窗孔密度仍维持在74%。随即探讨rhKal对HSEC窗孔的维持是否通过NO信号通路发挥作用。结果表明,rhKal对HSEC窗孔的维持作用,可以被PI3K抑制剂LY以及eNOS抑制剂L-NAME所阻断。rhKal可以使NOS的活性增加1.4倍（n=3,P<0.05）;NOx（氮氧化物）的表达增加1.7倍（n=3,P<0.05）。rhKal对eNOS的磷酸化以及NO表达的促进作用均可以被LY所阻断,表明rhKal对eNOS的激活以及NO分泌的促进作用,是通过PI3K-Akt通路介导。本文为全面探究Kal的抗纤维化机制提供了新依据。