论文部分内容阅读
干细胞是一类具有分化潜能和自我更新能力的细胞。因其独特的性质在疾病治疗、再生医学、发育生物学等多个领域发挥重要的作用。尽管干细胞在临床治疗中应用已久,但干细胞治疗仍然面临着细胞数量不足、体外培养易于分化等问题,影响干细胞的临床应用。鉴于目前利用添加条件培养基、血清替代物、生长因子等培养方法存在成分不明、性质不稳定、价格高昂等问题,有必要筛选价格低廉、性质稳定的小分子化合物以维持干细胞的多潜能性。Oct4基因是干细胞干性调控的最重要因子,其表达水平的变化直接影响干细胞的干性。因此本研究旨在筛选能通过促进Oct4基因表达来增强干细胞干性的小分子化合物,以作为干细胞二维培养的培养基添加剂,同时为重编程诱导剂的开发奠定基础。本研究首先以p EZX-MT01-Oct4-3’UTR荧光素酶报告质粒转染的细胞为筛选模型,筛选能够在转录后水平上提高Oct4基因表达的小分子化合物;之后通过探究化合物对干性因子表达及干细胞自我更新能力的影响,找到能够促进干细胞干性的小分子化合物;最后对得到的小分子化合物进行了初步的机制研究。1.对Oct4的表达具有转录后调控作用的化合物初筛为寻找能从转录后水平调控Oct4基因表达的化合物,以p EZX-MT01-Oct4-3’UTR荧光素酶报告质粒转染的细胞为筛选模型,对实验室购买的627种已上市药物进行初步筛选。荧光素酶活性检测结果表明,有66种药物都能明显促进荧光素酶的活性。提示这些化合物可能在转录后水平促进Oct4的表达。2.对Oct4的表达具有转录后调控作用的化合物复筛为寻找能真正靶向作用于Oct4 m RNA 3’UTR的化合物,分别将p EZX-MT01-Oct4-3’UTR或p EZX-MT01与p CMV-?-gal质粒共转染入细胞,之后分别加入初筛获得的目标化合物进行刺激。荧光素酶活性检测结果显示,化合物A8-61、A8-66、2A1-20、2A2-52、2A3-6、2A2-11能够明显增强荧光素酶的活性,说明它们可以特异靶向Oct4m RNA3’UTR。3.目标化合物对Oct4表达的影响Oct4蛋白的表达量是最终影响干细胞干性的决定因素。因此我们选取胚胎癌细胞P19作为靶细胞,检测目标化合物对Oct4表达的影响。Western blot检测结果表明,化合物2A1-20、2A2-52、2A3-6不能促进P19细胞中Oct4蛋白的表达,而A8-61、A8-66、2A2-11则可以增加P19细胞中Oct4蛋白的表达,提示这些化合物可能对干细胞的干性具有调控作用。4.目标化合物的无毒浓度分析为探究化合物A8-61、A8-66、2A2-11对P19细胞干性的影响,我们对不同浓度的三种化合物处理过的P19细胞进行细胞活力测定,确定IC10时化合物的浓度,并用低于IC10时的浓度研究化合物对P19细胞干性的影响。MTT检测结果表明,化合物A8-61、2A2-11在实验浓度范围内对P19细胞不具有毒性作用,化合物A8-61在40?g/m L时显著促进P19细胞增殖,化合物A8-66的IC值为7.644+0.182。5.目标化合物对干性因子Oct4、Sox2和Nanog表达的影响根据无毒浓度测定结果,我们选取了2.5?g/m L和5?g/m L作为研究三种化合物对P19细胞干性影响的实验浓度。WB检测结果显示,化合物A8-61、2A2-11在2.5?g/m L和5?g/m L时均能促进Oct4、Sox2和Nanog的表达,而化合物A8-66只在5?g/m L时促进Oct4、Sox2和Nanog的表达。6.目标化合物对P19细胞自我更新的影响上述结果表明,化合物A8-61、A8-66、2A2-11均能促进P19细胞多潜能因子的表达,是否三种化合物也能不同程度地促进P19细胞的自我更新能力呢?为阐明此问题,我们联合使用平板克隆培养方法和碱性磷酸酶染色法来探究P19细胞的自我更新能力。碱性磷酸酶染色结果显示,与对照组相比,化合物A8-61、2A2-11在2.5?g/m L和5?g/m L时均能促进P19细胞克隆的形成,而化合物A8-66只在5?g/m L时增强P19细胞的克隆形成能力。7.目标化合物维持P19细胞干性的信号通路研究为更好地了解化合物是如何促进P19细胞干性的,我们对化合物处理过的P19细胞进行干性相关信号通路研究。我们利用Western blot检测化合物处理P19细胞后干性相关通路PI3K/AKT、MEK/ERK关键因子的变化。结果显示,化合物A8-61在2.5?g/m L和5?g/m L均可促进AKT的磷酸化,提示2.5?g/m L和5?g/m L的A8-61可以通过激活PI3K/AKT信号通路来起到促进P19细胞干性的作用。化合物2A2-11可以促进PI3K和AKT的磷酸化,同时抑制ERK的磷酸化。提示2A2-11通过激活PI3K/AKT信号通路,抑制负向调控干性的MEK/ERK信号通路来促进干细胞干性。综上,本研究从627种上市药物中筛选出3种能够在转录后水平上促进Oct4表达并增强P19细胞干性的化合物,且初步探讨了其中二种化合物促进P19细胞干性维持的机制。本研究为体外大量扩增干细胞提供新的添加剂,同时为重编程诱导剂的开发奠定基础。