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猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus> CSFV)引起的一种高接触传染性致死性的猪传染病,以出血和高热为特征,感染的猪群常常大量死亡,造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属,是一种单股正链RNA病毒。Npro非结构蛋白是CSFV基因组首先翻译出来的蛋白质,具有CSFV自体蛋白酶活性,断裂后催化多聚蛋白成为12种成熟的病毒蛋白。Npro能够抑制FN-α/β转录的干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3),具有阻碍IFN-α/β诱导的作用。干扰素调节因子1(Interferon regulatory factor 1, IRF1)是一个重要的多功能转录因子。这个转录因子家族具有调节干扰素表达、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。并且,IRF1还选择性地调节不同基因在不同细胞中的免疫应答效应。本研究在先前的工作基础上,进一步探索Npro与IRF1的相互作用关系,但目前尚没有良好的抗Npro和抗IRF1的抗体商品销售,因此要先研制猪瘟病毒Npro蛋白的抗体,以便对猪瘟病毒蛋白的结构和功能进行进一步的探讨；而制备所得的IRF-1抗体,可以为研究CSFV感染时,IRF1与干扰素、干扰素刺激应答基因(Inierferon stimulated genes, ISG)等各种免疫应答因子的相关关系打下基础。首先扩增了猪瘟病毒基因组编码Npro蛋白基因片段和猪IRF-1基因,克隆到pMD18-T载体,再亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,成功构建了重组原核表达质粒pET-Nprp和pET-IRF-1。将pET-NPro和pET-IRF-1分别转到大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达,表达的蛋白产物经SDS-PAGE和Western blot检测,证实了Npro基因和IRF-1基因得到了有效的表达。Npro蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式表达,而IRF-1主要是以可溶性蛋白形式表达。本文对Npro和IRF-1的可溶性蛋白利用镍离子(Ni+)亲和层析的方法进行纯化,将纯化所得到的Npro和IRF-1的活性蛋白作为抗原,分别按免疫程序免疫4周龄的小鼠,制备这两种蛋白的多克隆抗体。结果显示,制备的抗Npro和抗IRF-1的小鼠血清,经用Western blot检测,抗Npro和抗IRF-1的多克隆抗体,两者能够分别和原核表达重组蛋白Npro和IRF-1发生良好的反应。进一步检测多克隆抗体的特异性,Npro蛋白的多克隆抗体能够与天然构象的猪瘟病毒Npro结合。PK-15细胞感染猪瘟病毒后,用IRF-1多克隆抗体可检测到IRF-1蛋白表达的变化,并且细胞感染猪瘟病毒后48 h能检测出IRF-1的表达量较高,同时,Npro蛋白的多克隆抗体能够特异性地识别PK-15细胞中真核表达的Npro蛋白。两种抗体的最适稀释度为1：2000,证明以上所制备的两个多克隆抗体具有良好的特异性和反应性。通过制备的抗体,运用实时荧光定量PCR、Western blot技术检测感染猪瘟病毒后PK-15细胞IRF-1的变化,发现IRF-1 mRNA水平上升,采用Western blot方法证明猪瘟感染可引起IRF-1翻译水平上升,说明IRF-1在猪瘟病毒感染过程中发挥重要作用。