类番茄茄(Solanum lycopersicoides)是茄属(Solanum)中番茄(Lycopersicon esculentum Mill)近缘野生种,在-1.25~5.3℃的条件下能正常开花结果。烟草(Nicotiana tabacum L.)为茄科(Solanleae)烟草属(Nicotiana)一年生或有限多年生草本植物,作为中国主要的经济作物之一,低温冻害一直制约着优质烟草的生产发展。CBF1基因是CBF家族的一种抗冷转录因子,它首先在拟南芥中被克隆出来。它能够诱导低温调节蛋白(COR蛋白)的表达,使未经过低温驯化的植株具备一定的抗冻力,因此通过转化CBF基因,可以提高烟草的抗冻性,从而提高烟草产量和改善其品质。当植物处于低温胁迫的状态下,较低的温度会使植物脱水并对植物细胞膜造成严重伤害,而抗冷转录因子对保护细胞膜结构起到了重要的作用,促使植株在某种程度上减缓或抵制低温。本试验以无菌烟草叶片为受体材料,采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草。研究结果如下:1、以烟草(中烟100)叶片为外植体,通过筛选各阶段的最适培养基建立了烟草的再生体系。其中,培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是烟草叶片不定芽分化的最佳培养基;MS+6-BA 2.0 mg/L是烟草不定芽增殖培养的最佳培养基;MS+NAA 0.1 mg/L是烟草不定芽生根培养的最佳培养基。2、将农杆菌侵染后的烟草叶片放入含有不同Kan浓度的筛选培养基中,筛选出抗性芽对Kan的抗性临界值。该临界值为50 mg/L的Kan溶液。3、确立了烟草的最佳转化体系:外植体预培养48 h,再用OD600为0.4左右的农杆菌菌液侵染外植体5 min,接种于含乙酰丁香酮(AS)的共培养培养基中,共培养48 h后除菌,头孢霉素(Cef)的除菌浓度为500mg/L。4、通过叶盘法对烟草进行遗传转化,获得5株转基因植株。采用CTAB法提取转基因植株DNA并进行PCR检测,得到大约750 bp的清晰条带,表明CBF1基因成功转入烟草中。5、对转基因烟草进行生理指标检测,经过4℃低温处理24 h和22℃恢复处理72 h后,SOD、POD、游离脯氨酸、CAT活性均增加,并高于未经转化烟草活性,而MDA活性降低且始终低于未转基因烟草活性,说明在一定程度上提高了烟草的抗冷性。