第一部分RSV-AG基因变异性分析：新基因型ON1的流行情况　　背景及目的：呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus，RSV）是引起婴幼儿时期下呼吸道感染最常见的病毒病原。粘附蛋白（Attachmentprotein，G蛋白）和融合蛋白（Fusionprotein，F蛋白）是RSV表面重要的糖蛋白，也是制备RSV疫苗的重要组分，其中G是RSV全基因组中变异性最大的基因，提示G基因面临着较大的免疫选择压力。对RSVG蛋白的分子流行病学特征和进化模式进行研究，具有重要的临床意义。RSV可根据抗体反应性和G基因差异分为A、B亚型（RespiratorysyncytialvirussubtypeA，RSV-A;RespiratorysyncytialvirussubtypeB，RSV-B）。2006-2009年流行病学研究结果显示，重庆地区2006-2008年RSV流行季节以RSV-A流行为主，GA2基因型是优势基因型，而2008-2009年以RSV-B流行为主，BA基因型为主要流行株。在前期研究的基础上，本研究进一步对在重庆地区2009-2013年流行的RSV-A亚型临床分离株G基因变异性进行分析，了解新基因型ON1的流行情况。　　方法：收集2009年6月到2013年5月在重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心一病房急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物（Nasopharyngealaspirates，NPA），提取RNA进行基因分型并RSV病毒分离培养。对分离培养获得的RSV-A临床分离株G基因和F基因扩增测序后进行系统进化分析，并进一步分析GenBank中收录的ON1基因型的基因序列和进化率。　　结果：本研究共收集3167份NPA，其中RSV检出阳性1035份（33％）。RSV-A和RSV-B分别检出阳性的有671份（65%）和343份（33%），另有21份（2%）RSV-A和RSV-B均检出。在2009-2010年和2012-2013年流行季节，RSV-B为重庆地区主要流行亚型；2010-2012年流行季节RSV-A为主要流行亚型。获得374株（15.49%）RSV临床分离株，其中RSV-A265株（70.86%），RSV-B108株（28.88%），1株（0.26%）为RSV-A和RSV-B均检出，250株RSV-AG基因测序成功。系统进化分析结果显示：重庆地区流行的RSV-A可归纳为NA1、NA3、NA4、GA1和新发现的具有72bp重复的ON1基因型，NA1为主要流行基因型（237株，94.8%），ON1基因型仅发现4株（1.6%）。综合重庆地区4株及GenBank中收录的124株ON1基因型G基因序列分析，发现ON1基因型已呈全球扩散趋势，同源性为98.5%，进化率为5.63×10-3核苷酸替换/位点/年。　　结论：重庆地区RSV-A和RSV-B交替流行，以NA1为RSV-A主要流行基因型。RSV-A新基因型ON1处于快速进化状态，已呈全球扩散趋势，可能成为2014年重庆地区RSV-A的主要流行株。　　第二部分RSV-BG基因变异性分析：新基因型GB5的流行情况　　背景及目的：在2006-2009年前期研究中，重庆地区2008-2009年RSV流行季节以RSV-B流行为主，BA基因型为主要流行株，但RSV-B的分子流行病学特征鲜有报道。本研究进一步对重庆地区2009-2013年流行的RSV-BG基因变异性及进化情况进行分析。　　方法：收集2009年6月到2013年5月在重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心一病房急性呼吸道感染住院患儿NPA，提取RNA进行基因分型并RSV病毒分离培养。对分离培养获得的RSV-B临床分离株G基因扩增测序后进行系统进化分析，并进一步分析了其氨基酸序列和进化率。　　结果：通过对本研究收集的3167份NPA基因分型后发现RSV-B是重庆地区2009年-2010年和2012年-2013年主要流行亚型。系统进化分析纳入102例重庆地区临床分离株及GenBank收录的68株中国RSV-B的G基因序列，结果显示中国地区RSV-B可分为BA基因型（111例，65.29%），GB3基因型（5例，2.94%）以及新基因型GB5（54例，31.77%）。GB5基因型氨基酸序列存在氨基酸替换，可能导致G基因第二高变区潜在的N-糖基化位点改变及中间保守区域第180位氨基酸错义突变（Q-R）。中国地区RSV-BG基因的进化率估计为2.01×10-3核苷酸替换/位点/年，与比利时和荷兰报道的RSV-BG基因进化率相似（分别是1.95×10-3和2.78×10-3核苷酸替换/位点/年）。　　结论：本研究发现RSV-B新基因型GB5在中国地区流行，为研究RSV-B在中国的流行情况提供了分子流行病学资料，有利于未来的RSV疫苗研发。　　第三部分血清RSV特异性中和抗体与RSV感染的相关性分析　　背景及目的：RSV是婴幼儿下呼吸道感染最常见和最重要的病毒病原。RSV-A、B亚型呈交替流行，但两者交替流行的原因尚不清楚。血清RSV特异性中和抗体滴度与RSV感染率成反比。G蛋白和F蛋白均能诱导RSV特异性中和抗体和提供相对长效保护性免疫的病毒抗原，其中F蛋白是RSV特异性中和抗体的主要作用靶点。本研究目的在于探讨RSVF蛋白特异性中和抗体是否为RSV-A、B亚型交替流行的原因。　　方法：采用表达绿色荧光蛋白（GFP）的RSV-A2株以及将RSV-A2F基因替换为RSV-BCH18537株F基因并表达红色荧光蛋白（mKate）的重组病毒RSV-A2/BF株作为测试病毒，利用流式细胞仪检测2009年8月到2010年9月收集的重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心一病房急性呼吸道感染住院患儿血清RSV特异性中和抗体水平，回顾性分析婴幼儿RSV特异性中和抗体水平与RSV感染及流行的关系。　　结果：本研究回顾性收集285份血清，其中150份血清相对应的NPARSV检出阳性（RSV-A检出55份，RSV-B检出95份）。在RSV检出组及RSV未检出组患儿血清中均存在RSV特异性中和抗体，但RSV未检出组血清RSV-A2特异性中和抗体及RSV-A2/BF特异性中和抗体滴度均显著高于RSV检出组（平均滴度分别为3.1±0.03VS.2.77±0.03和2.81±0.05VS.2.6±0.4，p<0.001）。在RSV-B检出组中，血清RSV-A特异性中和抗体显著高于RSV-A2/BF特异性中和抗体（p<0.001）。在RSV未检出组，血清RSV特异性中和抗体滴度在RSV亚型切换后均有升高，RSV-A2特异性中和抗体显著高于切换前水平（p<0.01）。在RSV-A检出组，各年龄组间血清RSV-A2特异性中和抗体水平不一，在6-11月龄组最低，呼吸道症状出现时间≥12天组患儿血清RSV-A2特异性中和抗体水平显著高于呼吸道症状出现时间<12天组（2.97±0.11VS.2.68±0.06，p=0.02）。　　结论：婴幼儿体内存在RSV特异性中和抗体，该抗体水平对RSV感染具有保护性效应，且根据年龄、病程和季节呈动态变化。本研究仅收集处于RSV-A和RSV-B交替时间点前后一年的住院患儿相关标本，时间较短，不能完全明确RSV亚型交替流行的原因，G蛋白特异性中和抗体可能发挥了重要作用。