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Argonaute（Ago）蛋白广泛存在于真核和原核生物中。其中真核Ago（eukaryotic Argonaute,e Ago）在RNA干扰（RNA interference,RNAi）和基因沉默过程中发挥关键作用,e Agos结合引导RNA（guide RNA,g RNA）分子靶向互补配对的RNA导致转录后沉默。原核Ago（prokaryotic Argonautes,p Ago）蛋白在古细菌和细菌中的功能和特征与e Agos相比具有惊人的多样性。许多p Agos具有与核酸相互作用的保守结构域变体,同时具有e Agos中不存在的额外结构域,这表明它们在核酸识别和切割中可能具有不同寻常的特异性。许多p Agos与同一基因或操纵子中的假定核酸酶,解旋酶和DNA结合蛋白相关,提示p Agos参与了靶标核酸的加工。e Agos蛋白及其RNAi途径已经被广泛用作研究中的有力工具和潜在的治疗方法。相比而言,研究p Agos的多样性和功能则在发现新的细胞途径和基因组操纵的新工具方面具有巨大的潜力。现有数据表明,p Agos参与原核基因组的保护,即针对某些外源性遗传元件的宿主防御,例如质粒,转座子和噬菌体等。目前只有极少数的p Agos已通过结构或生化方法进行了表征。与e Agos相比,有关p Agos功能的实验数据非常稀缺。2016年在《自然.生物技术》（Nature Biotechnology）上发表的一篇文章提出格氏嗜盐碱杆菌Ago蛋白（Ng Ago）可用于人类细胞基因编辑,但是该研究结果由于无法被重复在全世界范围引起了很大争议。迄今为止,几乎所有Ng Ago相关的研究都是使用Ng Ago-g DNA系统靶向外源性DNA/RNA研究其基因编辑功能,而Ng Ago在格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi SP2）中天然的引导分子和核酸靶标却仍是未知的,而这对于研究Ng Ago的功能至关重要。本课题围绕这一问题展开研究,探索Ng Ago在N.gregoryi SP2本身细胞内的核酸配体结合偏好并进行表征。本文的主要研究内容如下:1、古细菌N.gregoryi SP2菌株具有极端嗜盐嗜碱特性。我们从中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Cture Collection Center,CGMCC）购买编号为1.1967的格氏嗜盐碱杆菌（ATCC 43098/NCIMB 2189/JCM8860）,按照培养标准复苏培养。该菌是一种红色、需氧的嗜盐碱杆菌,培养周期大约为5天。我们对该菌株进行了全基因组测序,基因组测序数据已提交在Gen Bank数据库中（PKKI00000000）,并将其与美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）中Gen Bank数据库已收录的2个N.gregoryi SP2基因组数据进行了统计对比。我们对N.gregoryi SP2的基因进行了COG分析、GO分类以及KEGG通路分析,并重新注释了N.gregoryi SP2基因组中的三个基因,分别为II型分泌系统蛋白E,Sir A家族蛋白和未表征的膜蛋白Yei H,这些蛋白在这之前被注释为假定蛋白。2、通过Bam HI和Xho I双酶切位点将源质粒p BBR-Tac-Ng Ago中PIWI序列构建于表达质粒Pet-28a,构建为重组表达质粒p ET-28a-PIWI,然后在Rosetta菌株中表达了Ng Ago的保守结构域PIWI。PIWI继而作为免疫原多点皮下注射新西兰白兔,制备anti-PIWI抗体。与此同时,培养了N.gregoryi SP2菌株,经过16S r RNA基因测序鉴定为目标菌株。anti-PIWI抗体和N.gregoryi SP2菌株用于后续免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）实验,染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验和RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验。3、免疫沉淀实验中N.gregoryi SP2细菌裂解液与anti-PIWI抗体作用,从富集到的Ng Ago蛋白复合物中分离核酸进行测序和分析。Qubit fluorometer和Agilent2100 Bioanalyzer检测结果显示复合物中只有RNA。进一步的RNA-seq表达数据分析表明Ng Ago在N.gregoryi SP2菌内主要与nc RNA（ffs和rnp B基因）,t RNA和其他RNA（non-histone chromosomal MC1 family蛋白,cold-shock蛋白以及twinarginine translocation signal domain-containing蛋白）结合。4、继IP实验后又分别做了Ch IP和RIP实验,分别特异性富集Ng Ago在N.gregoryi SP2细胞内结合的DNA和RNA进行测序分析。实验结果表明,Ng Ago在体内直接结合RNA,非特异性结合DNA。Ng Ago结合的RNA主要是t RNA以及转录调节子,RNA聚合酶和RNA结合蛋白的转录本。Ng Ago主要与基因内部或其上游序列的转录本结合。对RIP-Seq数据查找到的peaks区域的序列进行motif分析发现最显著的motif与mi R-1289序列最相似,GO富集分析表明peaks相关的基因在跨膜转运生物过程中富集。综合分析结果表明Ng Ago内源性结合RNAs并可能在体内发挥转录后调控作用。综上所述,本课题围绕Ng Ago在古细菌N.gregoryi SP2细胞中内源性核酸配体进行了研究,提出Ng Ago在N.gregoryi SP2中本身是直接与RNA结合,RNA是其天然靶标,为Ng Ago后续研究奠定了基础。Ng Ago作为原核Agos中重要的一员,对Ng Ago的功能进行表征具有重要的科学意义。