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近年来,随着人们的生活水平不断提高以及畜牧业的快速发展,在追求畜产品数量的同时,消费者对肉类产品质量的标准与以前相比也越来越高,肉质评定中最重要的指标为大理石花纹,即肌内脂肪(IMF)的沉积情况,IMF的含量与牛肉适口性高度相关,可以影响牛肉的多汁性,嫩度和风味。因此,必须提高我们对影响IMF沉积的分子机制的理解,以便基因组选择可用于生产质量稳定的高档牛肉。而肌内脂肪的形成一部分是由于脂肪细胞的分化,另一部分是由其他肌源性干细胞的转分化而形成。本试验以延边牛阉牛为动物模型,在细胞层面上利用化学诱导方法调控PPARγ表达,从而调控脂肪形成。主要分为以下三个试验:试验一:延边牛骨骼肌卫星细胞模型的建立为探究PPARγ基因对延边牛肌内脂肪沉积的影响,本研究以延边牛后臀部骨骼肌的半膜肌为试验材料,利用链霉蛋白酶消化分离法分离细胞,建立起延边牛原代骨骼肌卫星细胞体外培养模式;采用差速贴壁法纯化细胞;利用形态学上及免疫荧光法共同鉴定骨骼肌卫星细胞;利用MTS法检测并绘制生长曲线探究骨骼肌卫星细胞的增殖分化规律。研究结果如下:纯化后的细胞生长呈梭型,细胞与细胞间接触,发生细胞间彼此融合,从而形成多核肌管,并且在免疫荧光染色后,MyoD蛋白、Pax7蛋白和Desmin蛋白呈阳性,MTS法检测细胞增殖并绘制曲线为“S”型生长曲线。从而鉴定本试验提取细胞为骨骼肌卫星细胞;并成功建立可用于后续研究的延边牛骨骼肌卫星细胞模型。试验二:环格列酮对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响本研究旨在探讨不同浓度环格列酮(CL:5 μM,CM:10 μM,CH:20μM)对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。结果表明,用环格列酮分化处理延边牛骨骼肌卫星细胞96 h以后,延边牛骨骼肌卫星细胞由原来的梭型形态转变为圆形,与对照组(CON)相比,环格列酮组(CL,CM,CH组)肌管减少甚至消失,并且有脂滴生成,且脂滴面积与环格列酮的不同浓度高度相关,并且伴有剂量依赖性关系(P<0.01);与对照组(CON)相比,添加环格列酮后,各试验组(CL,CM,CH组)的甘油三酯合成显著增加(P<0.01),并且伴有剂量依赖关系;实时荧光定量RT-PCR反应结果表明:与对照组(CON)相比,各试验组(CL,CM,CH组)的PPAR γ,C/EBPα,C/EBPβ,FABP4,FAS,ACC,SREBP1,LPL,GPR43,SCD,AMPKα,PLIN2,Pax3和Pax7基因表达显著上升(P<0.01),并且显著降低了 CPT1,MyoD,MYOG,MYF5和MRF4的表达(P＜0.01);蛋白免疫印迹反应结果显示:与对照组(CON)相比,各试验组(CL,CM,CH组)的成脂重要蛋白PPARγ,C/EBP α,SREBP1及脂滴形成重要蛋白PLIN2的表达明显增加,成肌重要蛋白MyoD和MYOG表达下降。与对照组(CON)相比,各试验组(CL,CM,CH组)的脂联素(ADP)分泌量显著上调(P<0.01)。这些结果表明,环格列酮可以促进延边牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。试验三:调控PPARγ的表达对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响本研究主要探究在延边牛骨骼肌卫星细胞中单独添加环格列酮(C:10 μM),GW9662(G:10 μM),及二者共同添加(CG:10μM 环格列酮+10μM GW9662)对骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。分化96h以后的结果表明,与对照组(CON)和单独添加GW9662组(G组)相比,单独添加环格列酮组(C组)和二者共同添加组(CG组)的肌管减少,细胞由梭型变为圆形,并且有脂滴生成;与对照组(CON)相比,单独添加环格列酮组(C组)的甘油三酯显著增加(P<0.01),单独添加GW9662组(G组)的甘油三酯量显著下降(P<0.01);实时荧光定量RT-PCR结果显示:与对照组相比,C 组和 CG 组的 PPAR γ、C/EBP α、C/EBP β、SREBP1、FAS、ACC、LPL、FABP4和GPAR43基因显著上调,且两组差异显著,G组除GPR43基因无显著差异,其他成脂基因显著下调(P<0.01);与CON组相比,C组SCD基因显著上调(P<0.01),其他两组无明显差异(P>0.05),且与对照组相比,C组的Pax3基因显著上调(P<0.01),Pax7基因的显著下调(P<0.01);C组和CG组的MYOG、MyoD、MRF4、和MYF5基因表达量显著下调,G组显著上调MYF5的基因表达量(P<0.01)。蛋白免疫印迹反应结果显示:与对照组(CON)相比,C组和CG组的成脂相关蛋白PPAR γ、C/EBPα、PLIN2及SREBP1蛋白的表达量增加,G组蛋白下降趋势;各处理组成肌相关蛋白MYOG呈下降趋势,C组的MyoD蛋白表达量明显减少,G组的表达量明显增加;与对照组相比,试验组的Pax7蛋白表达量呈下降趋势。并且与对照组(CON)相比,C组和CG组的脂联素(ADP)分泌量显著上升,G组显著下降(P＜0.01)。这些结果表明,上调PPAR γ的表达可以促进延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化,下调PPAR γ表达抑制延边黄牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞分化。综上所示,本研究表明PPARγ激动剂环格列酮可以促进延边牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞转分化。