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一、背景和目的为了有效控制术中出血,肝脏外科手术时常需要阻断入肝血流,但随着肝脏血流阻断时间延长,肝门开放后,就不可避免的会引起肝脏缺血再灌注(I/R)损伤。国内外大量的研究对肝缺血再灌注损伤的机制有了基本的认识,认为其发生机制主要与以下几个方面作用有关:肝微循环障碍;氧自由基;钙超载;细胞因子和炎症介质等。而细胞因子如何导致肝缺血再灌注损伤的机制仍未明确。本实验通过建立小鼠肝缺血再灌注模型,来研究细胞因子在其中可能的损伤机制。二、材料和方法1.实验动物雄性C57BL/6小鼠(清洁级),6-8周龄,体重16-20g。2.实验方法将健康雄性C57BL/6小鼠24只随机分为4组:A组、B组、C组和D组,所有动物术前12小时禁食不禁水,0.2%戊巴比妥钠溶液按60mg/kg体重腹腔注射麻醉后,固定,腹部备皮消毒,沿腹正中线作切口,暴露肝脏。其中B,C,D组用无损伤夹夹闭左肝入肝血流,减少术中直接对肝脏的损伤,均予以75分钟的肝缺血。其中B组为肝缺血75分钟再灌注2小时、C组为肝缺血75分钟再灌注6小时和D组为肝缺血75分钟再灌注24小时,在肝缺血后要再灌注时均予以关腹,术后小鼠自由进食。其中A组为假手术组,只予以开腹,而不进行其他任何处理。3.实验标本及取材每组均于再灌注后从眼球球后静脉丛取血,再处死取肝缺血再灌注部分的肝脏。小鼠血液静置30min后以3000rpm/min离心10min,吸取上清液(血清)放于4℃保存。一部分肝组织放于10%甲醛固定,另外放于-70℃保存。4.实验指标测定1)血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)测定:取血清标本,用日本柯达250型全自动生化分析仪测定ALT、AST。2)病理组织学检查:取肝脏标本,10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色后用普通光学显微镜观察,并进行肝缺血再灌注损伤病理评分。3)肝组织MPO测定:取肝组织标本100mg,用髓过氧化物酶(MPO)测试盒测定MPO的活性。4)肝组织TNF-α和IL-1βmRNA表达水平:用Real time PCR测定组织中TNF-α和IL-1βmRNA的水平。三、结果1.ALT、AST的变化:肝脏缺血再灌注后,B、C、D组血浆肝功能酶学指标均显著升高,随着再灌注时间的延长升高逐渐减少(B、C、D组与A组比较及B组、C组与D组比较,P＜0.01)。2.组织病理学:光镜下表现再灌注2小时肝组织明显水肿变性,局部肝细胞空泡化明显,部分有片状坏死,肝窦淤血并变窄。各组组织病理学评分(B、C、D组与A组比;B组与C、D、A组比,P＜0.05)。3.MPO含量测定:B、C、D组肝组织中MPO含量升高,以再灌注2小时最明显(B组与A、C、D组比P＜0.01)。4.肝组织TNF-α和IL-1βmRNA表达水平:B、C、D组肝组织中IL-1βmRNA表达增加,以再灌注2小时最明显(B组与A、C、D组比P＜0.01);TNF-αmRNA在B、C、D组表达水平均增高(与A组比P＜0.05)。四、结论炎症介质的释放可损伤血管内皮细胞,从而导致微循环出现障碍。而细胞因子可激发和维持炎症反应,同样导致再灌注损害,其中肿瘤坏死因子(TNF)-α和(白介素)IL-1β是涉及肝I/R的两大重要细胞因子。