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目的:观察蠲痹胶囊对绝经后膝骨关节炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路及其关键因子表达的影响,探讨蠲痹胶囊防治绝经后膝骨关节炎的可能作用机制。方法:(1)选取30只5月龄雌性未孕豚鼠,应用豚鼠自发造模方法建立原发性膝骨关节炎动物模型,采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化方法分离提取5月龄膝骨关节炎豚鼠模型成纤维样滑膜细胞(FLS)和软骨下成骨细胞(OB),并对细胞进行体外培养、传代,通过倒置显微镜、HE染色观察细胞基本形态;通过免疫组化和免疫荧光CD44、CD55、Vinmentin、CD90、CD68对成纤维样滑膜细胞(FLS)进行细胞表面标记物鉴定;通过碱性磷酸酶染色(ALP)和茜素红染色完成软骨下成骨细胞(OB)的鉴定。(2)选取32只5月龄雌性膝骨关节炎模型豚鼠随机分为蠲痹胶囊组、西药组(双醋瑞因胶囊)、模型组、假手术组,在此基础上采用双侧卵巢切除法建立绝经后膝骨关节炎复合动物模型。蠲痹胶囊组动物给予蠲痹胶囊水溶液灌胃干预,西药组动物给予双醋瑞因胶囊水溶液灌胃干预,而模型组和假手术组动物给予等量纯水灌胃干预。灌胃结束后,腹主动脉采血法采血,制备蠲痹胶囊组、西药组(双醋瑞因胶囊)、模型组、假手术组的含药血清,筛选最适血清并用其干预成纤维样滑膜细胞(FLS)和软骨下成骨细胞(OB)。细胞干预结束后,收集保留各组细胞最后一天干预结束时培养孔中的细胞培养液,离心并保留上清液;Trizol法提取成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞内总RNA;增强型RIPA裂解液裂解细胞,提取成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞内总蛋白。Elisa法测定模型组和假手术组血清中雌激素含量以及含药血清干预后各组细胞上清液中TNF-α的含量;RT-PCR法检测细胞内TLR4、TRAF6基因表达水平;Western blot法检测细胞内NF-κBp65蛋白表达水平。使用Pathway Builder Tool、SPSS22.0、Graph Pad Prism 8.0.2、Image J软件实验作图、建立基础数据库、图片处理及统计学分析处理。结果:(1)原代成纤维样滑膜细胞(FLS)通过体外培养、传代可以将其进一步纯化,当培养到第三代时,FLS大多呈纺锤状、不规则梭形、多边形、类三角形、星形,旋涡状聚集分布生长,卵圆形的细胞核位于细胞中央,形态学上符合成纤维样滑膜细胞(FLS)的特征,细胞表面特异性标志物免疫组化、免疫荧光CD44、CD55、Vinmentin、CD90鉴定,细胞质及核膜可见大量阳性表达物质,CD68组细胞质及核膜未见明显阳性表达,于PBS对照组比较无差异,进一步证实了该细胞为成纤维样滑膜细胞(FLS);软骨下成骨细胞(OB)呈线条状聚集分布生长,细胞呈梭形、类三角形,部分细胞借助突触相连接,卵圆形的细胞核沿细胞长轴分布。此外软骨下成骨细胞(OB)经ALP染色、茜素红染色可见大量碱性磷酸酶沉积及钙化结节产生,结合其生物学特性,证实该细胞为软骨下成骨细胞(OB)。(2)Elisa法测定模型组与假手术组豚鼠血清中雌激素水平,模型组血清雌激素含量较假手术组明显下调(P<0.05),由此证明绝经后膝骨关节炎复合动物模型成功建立。Elisa法测定各组成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞上清液中TNF-α表达水平,结果示成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞各组细胞上清液中:与假手术组比较,模型组TNF-α表达水平明显上调(P<0.05);与模型组相比,蠲痹胶囊组TNF-α表达水平显著下调(P<0.05),西药组(双醋瑞因胶囊)TNF-α表达水平显著下调(P<0.05);与西药组(双醋瑞因胶囊)相比,蠲痹胶囊组TNF-α表达水平无明显变化(P>0.05)。(3)成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞RT-PCR结果示:与假手术组相比,模型组TLR4、TRAF6基因表达水平显著上调(P<0.05);与模型组相比,蠲痹胶囊组TLR4、TRAF6基因表达水平显著下调(P<0.01),西药组(双醋瑞因胶囊)TLR4、TRAF6基因表达水平显著下调(P<0.01);与西药组(双醋瑞因胶囊)相比,蠲痹胶囊组TLR4、TRAF6基因表达水平无显著变化(P>0.05)。(4)成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞Western blot结果示:与假手术组相比,模型组NF-κBp65蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与模型组相比,蠲痹胶囊组NF-κBp65蛋白表达水平显著下调(P<0.05),西药组(双醋瑞因胶囊)NF-κBp65蛋白表达水平显著下调(P<0.05);与西药组(双醋瑞因胶囊)相比,蠲痹胶囊组NF-κBp65蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。结论:(1)成功分离培养雌性豚鼠膝骨关节炎模型成纤维样滑膜细胞(FLS)和软骨下成骨细胞(OB),并经过纯化、鉴定,可为后续膝骨关节炎机制和通路的研究提供体外细胞模型。(2)蠲痹胶囊可能通过抑制成纤维样滑膜细胞(FLS)内TLR4、TRAF6基因表达,抑制成纤维样滑膜细胞(FLS)内NF-κBp65蛋白表达,降低成纤维样滑膜细胞(FLS)外TNF-α等炎性因子表达水平,调控固有免疫应答传导过程,从而减缓滑膜免疫炎症反应,延缓关节软骨及软骨下骨退变,最终达到防治绝经后膝骨关节炎的目的。(3)蠲痹胶囊可能通过抑制软骨下成骨细胞(OB)内TLR4、TRAF6基因表达,抑制软骨下成骨细胞(OB)内NF-κBp65蛋白表达,降低软骨下成骨细胞(OB)外TNF-α等炎性因子表达水平,调控固有免疫应答传导过程,从而减缓滑膜免疫炎症反应,延缓关节软骨及软骨下骨退变,最终达到防治绝经后膝骨关节炎的目的。