附子多糖提取、分离、纯化、结构鉴定与免疫调节作用的研究

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中药附子,属于毛莨科乌头属,主要产于中国南部,尤其四川省。作为一种草药,千百年来在东方传统医学中它被作为一种重要的治疗药物,被收入1977年版本的中华人民共和国药典和日本药典第7次修定版中。 附子制剂和各种含有附子的中药复方如,参附汤、四逆汤在中医临床中广泛的被用.丁促进血循环,增强免疫力,治疗心肌缺血、心力衰竭、神经痛、风湿病和痛风等疾病,也被用丁滋补强身和延缓衰老。 中草药一直是药物开发的一个重要来源。至今,乌头属中被研究的最多的药学成分是一组乌头碱。然而很少有人研究它的碳水化合物成分,直到1986年Konno报道从日本乌头的根中分离出了具有降血糖作用的多糖。这表明另一类生物活性成分——多糖很可能也在乌头属植物的药物治疗应用中发挥了重要的作用。然而近20年米有关乌头属多糖的研究鲜有报道,更未有对其结构的明确鉴定。本课题做了如下工作: (一)附子多糖的提取、分离、纯化和结构鉴定 本研究应用热水提取,阴离子交换联合凝胶渗透层析从附子中提取出一种名为FPS的水溶性多糖。进而应用高效液相色谱(HPLC),FT-IR,多维核磁共振波谱(NMR),甲基化分析和气相色谱-质谱联用(GLC-MS)来分析鉴定其纯度、分子量和化学结构的特征。基于获得的化学结果及一维、二维核磁共振波谱数据,FPS被确定是一种带支链的α-(1→6)-D-葡聚糖,平均分子量为14,000 Da,纯度大于99.8﹪。这种葡聚糖具有高度分支的结构,沿着主链平均每隔四个糖残基在C-3位点有一个单独的支链葡萄糖。我们发表论文首次对这种附子多糖进行了报道。 (二)附子多糖对免疫的调节作用 1)附子多糖对正常及免疫抑制小鼠免疫功能的影响在小鼠体内外的免疫药理学研究中,口服附子多糖不仅对正常小鼠具有免疫促进作用,还可以明显对抗环磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下,增加小鼠胸腺和脾脏重量,增强小鼠碳廓清能力,NK细胞活性,促进体内特异性抗体生成;并且体内外应用都可增强CotlA和LPS诱导的小鼠脾T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖转化的能力,功效在一定范围内随着剂量增大而增强。 2)附子多糖对人外周血淋巴细胞免疫功能的影响在T细胞丝裂原PHA,B细胞丝裂原LPS的激活作用下,附子多糖可以剂量依赖性的增强人外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖转化能力,促进B淋巴细胞分泌非特异性的IgM和IgG,增强外周血淋巴细胞分泌Th1和Th2类细胞因子的活性。FPS随浓度增高可单独,或协同PHA促进PBMC分泌细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α。但FPS与LPS联合不但对IFN-γ、IL-4的分泌没有协同促进作用,反而很大程度的抑制了LPS诱导的TNF-α分泌。 3)附子多糖对人THP-1细胞免疫功能的影响及其作用机制本研究从附子多糖对单核一巨噬细胞细胞因子TNF-α分泌、基因转录以及蛋白表达的影响入手,揭示附子多糖免疫调节活性的作用机制。ELISA、RT-PCR、Western blot以及NF-KB的DNA结合活性检测结果显示:FPS可剂量依赖性增加THP-1细胞培养上清中TNF-α和IL-12的含量,细胞中细胞因子mRNA表达和蛋白质分子合成相应增强,转录调节因子NF-KB的DNA结合活性同样增强。LPS存在条件下,FPS可剂量依赖性的抑制LPS诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-12。EMSA结果表明NF-KB同样参与了这一过程,说明FPS可能通过抑制LPS诱导的THP.1细胞中NF-KB活化,细胞因子mRNA表达与合成从而降低了分泌到细胞外的细胞因子。提示NF-KB信号通路介导了FPS的免疫调节作用。 4)附子多糖免疫调节作用的受体靶点Toll样受体是活化天然免疫与适应性免疫的重要受体家族。本研究选择人单核。巨噬细胞系THP-1细胞上的TLR4和TLR2受体为候选作用靶点,应用特异性受体抗体阻断TLR4、TLR2或联合阻断后,FPS促进细胞因子TNF-α分泌的活性受到抑制,细胞中NF-KB的DNA结合活性降低,TNF-α mRNA表达和蛋白质分子合成相应减少,提示附子多糖是通过单核-巨噬细胞表面TLR2和TLR4受体进行信号传导,改变免疫调节因子在细胞内的转录和表达从而发挥免疫调节作用的。而TLR4被认为是LPS作用的关键受体,因此推测FPS可能通过与LPS竞争激活TLR4从而抑制了LPS诱导的细胞因子(如TNF-α,IL-12)过量分泌。 综上所述,本研究通过化学裂解及二维核磁共振波谱分析首次阐明了从中药附子中提取分离出的一种新颖的具有免疫调节作用水溶性α-D-葡聚糖的化学结构特征,推断出其是一种带α-(1→3)支链的α-(1→6)-D-葡聚糖。它对健康或免疫抑制小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、特异性以及非特异性免疫NK细胞活性均有提高作用。它还可以促进人外周血淋巴细胞分泌细胞因子与免疫球蛋白。附子多糖这些免疫调节作用是通过Toll样受体信号传导途径来实现的,可能首先激活了单核巨噬细胞表面的TLR2和TLR4受体,进而活化转录调节因子NF-kB,增强细胞中多种细胞因子的基因转录和表达,从而调节了机体的免疫功能。
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