背景:布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁杆菌（简称布菌）引起的变态反应性人兽共患传染病,是目前我国面临最严重的公共卫生问题之一。布病不会自行痊愈,常转变成慢性病累及全身多个器官或脏器系统,严重威胁人类和多种动物的生命健康。在布病的众多临床症状中,炎症几乎贯穿于布病的所有病程。在我国,羊种布菌引起的人布病最为常见。布菌是一种兼性胞内病原菌,不表达经典的毒力因子。布菌入侵机体后形成布氏小体并在宿主细胞的内质网内定植和复制,过程非常复杂,且具体机制尚未清楚。脂蛋白是布菌外膜蛋白组分,在布菌的生长、复制和侵染细胞等重要生命周期过程中发挥重要作用。因此,探明布菌脂蛋白与布菌毒力的关系及其作用的分子机制有重要科学意义和应用价值。调节性T细胞（Tregs）是一类控制机体自身免疫反应的T细胞亚群,受感染的机体为了维持稳态降低炎症对机体的损伤,诱导Tregs的产生。布菌感染诱导Tregs抑制炎症,但同时也减弱了机体对布菌的清除作用,并有利于其在体内的生存,造成持续感染。因此,了解布病患者机体Tregs水平能为评估布病患者免疫状态,治疗效果及转归提供重要参考依据。目的:1.通过研究羊种布菌外膜蛋白OMP19和OMP16（脂蛋白,L19和L16）在布菌感染过程中引起宿主细胞程序性死亡和炎症的毒力作用,尤其揭示L19和L16诱导宿主细胞焦亡,以及与其它死亡方式相互转换的过程中发挥的生物学功能,探明布菌脂蛋白作为布菌毒力因子的分子机制。2.调查布病患者治疗前后外周血Tregs和相关细胞因子水平,了解布菌感染诱导宿主产生免疫抑制对慢性期布病治疗效果的影响。方法:1.研究脂蛋白L19和L16的毒力作用。1)L19和L16在布菌感染诱导细胞程序性死亡中的生物学功能。将外膜蛋白孵育激活的THP-1,观察并记录细胞形态的改变,检测细胞焦亡、凋亡率,以及其他的细胞死亡相关指标。2)L19和L16在布菌感染引起宿主炎症中发挥的作用。采用ELISA或WB的方法,检测外膜蛋白孵育THP-1细胞后产生的细胞因子;2.L19和L16毒力作用的分子机制。1)采用WB、实时荧光定量PCR等方法检测细胞焦亡执行蛋白和炎症因子的表达,ELISA检测炎症因子的分泌表达情况;2)通过特异性抑制剂干扰NF-κB和p38 MAPK通路,检测1.2)中相关蛋白或细胞因子的表达变化。3.调查慢性期布病患者外周血Tregs含量的变化及其相关细胞因子的分泌情况。采用流式细胞术,检测慢性期布病患者治疗前、后外周血中Tregs的水平;ELISA检测IL-10、IL-2、TGF-β、IFN-γ在治疗前、后的分泌,分析患者免疫状态的变化。结果:1、脂蛋白能诱导细胞发生焦亡。1)L19和L16使活化的THP-1出现细胞肿胀死亡的现象,尤其以L16较明显;并刺激细胞分泌炎症因子IL-6,TNF-α,IL-1β以及IL-18。2)L19和L16促进THP-1细胞中Caspase1的活化,且无蛋白特异性;同时,L19和L16刺激炎性因子IL-1β和IL-18的释放,使细胞发生焦亡。THP-1细胞中存在焦亡执行蛋白GSDMD和GSDME的全长片段,但经QPCR检测发现,L19和L16都能上调GSDME mRNA的表达水平,尤其L16上调更加显著;另外,THP-1被L16刺激4h后即可发生细胞凋亡,并在24h后细胞大量死亡。2、脂蛋白差别诱导细胞焦亡和炎症。1)L19和L16激活焦亡执行蛋白的情况不同:L19和L16都激活了Caspase-1/GSDMD执行的焦亡;然而,L16还能同时激活Caspase-3/GSDME执行的焦亡,导致细胞大量死亡。2)L19和L16刺激细胞产生不同大小的IL-18剪切片段:具体表现为L19主要产生18kd的IL-18,而L16则为15kd和16kd,但对二者刺激细胞中的mRNA检测发现,两组细胞中IL-18的mRNA表达水平均发生了上调,且两组间无统计学差异,说明不同大小IL-18的产生与mRNA表达水平无关。3)脂蛋白诱导的细胞因子分泌所依赖的信号通路不同。L19刺激活化的THP-1细胞分泌的IL-1β依赖于p38 MAPK和NF-KappaB信号通路,而L16刺激细胞分泌的IL-1β只依赖p38 MAPK通路;两个蛋白刺激细胞分泌的IL-6和TNF-α则具有p38 MAPK通路依赖性。3、病患者外周血中Treg含量调查。1)35例慢性布病患者外周血中的Tregs含量,测定结果显示,Tregs水平在治疗前与治疗后无统计学差异,但均显著高于健康对照组。2)标准治疗组和免疫增强剂组外周血的Tregs含量,测定结果显示,不同治疗组之间,以及治疗前后均无显著性差异。3)ELISA结果显示,与治疗前相比,患者外周血中IL-10,TGF-β和IL-2并未因治疗而发生显著性变化,而且上述细胞因子的含量均高于健康人群对照组;同时,采取不同的治疗方案对患者进行治疗时,其体内相关的细胞因子水平也未存在显著性差异。4)与健康对照组相比,患者的IFN-γ水平未显著性升高,且在治疗前、后也未见明显变化。结论:1、L19和L16对THP-1细胞呈现出不同的毒力。L19和L16刺激炎性因子IL-1β和IL-18释放,使细胞发生焦亡。而且,L16能在早期诱导细胞凋亡,并能诱导Caspase3/GSDME执行的焦亡。2、L16能活化Caspase3,可能通过Caspase3将IL-18剪切为15,16kd大小的片段,影响效应细胞合成IFN-γ,进而参与抑制IFN-γ介导的细胞免疫应答。3、L19和L16刺激细胞产生细胞因子与NF-κB,p38通路相关。4、慢性布病患者外周血中Tregs含量长期维持在一定高位水平,患者接受治疗（包括不同治疗方案）,并不能显著性降低其外周血中Tregs的含量。5、慢性布病患者外周血中免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β的分泌显著性增加,且以IFN-γ介导为主的细胞免疫应答受到抑制。