仔猪腹泻(diarrhea)是当前国内外养猪业面临的一大难题,每年因此造成的经济损失非常巨大。导致仔猪腹泻的主要致病菌是产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC),其致病过程依赖菌毛黏附素和肠毒素的共同作用。目前,防治仔猪腹泻最有效方法就是疫苗预防,但是传统ETEC疫苗的开发和应用还存在着很多缺陷和不足,其中疫苗使用的地区限制性、实效性、安全性问题首当其冲。本研究将菌毛和肠毒素两个致病因子都作为疫苗抗原,涵盖导致腹泻肠毒素类型以及主要菌毛类型,对腹泻发病的各个环节都进行保护,保证了疫苗的广泛适用性和高效性；同时本研究采用基因重组技术将几种肠毒素蛋白融合,而且去除了肠毒素毒力保留并增强免疫原性,避免了全菌抗原使用时带来的安全风险。本研究首先对大连得胜地区猪场的腹泻情况进行调研,分别采用麦康凯平板法以及PCR方法筛选并分析导致腹泻的致病菌类型。采用肠毒素LTB和STb基因引物进行PCR检测的结果显示,腹泻便样中分离得到的大肠杆菌确定为产肠毒素大肠杆菌,而且全部菌株都分泌STb耐热性肠毒素、大部分菌株分泌不耐热性肠毒素LTB；采用F4、F5、F6、F41菌毛基因引物PCR检测的结果显示,本地区猪场中ETEC的菌毛类型全部为F41,其他菌毛基因检测结果为阴性。在提取制备疫苗所需的重组三价肠毒素蛋白和菌毛蛋白的过程中,本研究对重组肠毒素蛋白的提取纯化方法进行了优化,并且探索了菌毛高效表达的方法。首先,针对重组三价肠毒素蛋白的提纯,本研究使用了稀释-透析-超滤离心多重去除变性剂的方法,使目的蛋白的纯度由11.2%提高到接近100%,同时目的蛋白在提纯过程中损失较少,产率也随之提高；随后在提取菌毛蛋白的研究过程中,对比了改良Minca培养基、LB培养基、TSB培养基中菌毛蛋白的表达量,SDS-PAGE电泳分析结果显示改良Minca培养基中菌毛蛋白的表达量要高于其他两种培养基。本研究制备了重组三价肠毒素及菌毛多价复合疫苗、重组肠毒素疫苗、菌毛疫苗、猪场灭活全菌苗,采用小鼠和成年猪进行疫苗的安全性试验后,对妊娠母猪进行免疫,以期考察疫苗的免疫效力。仔猪被动免疫结果显示,经过复合疫苗免疫母猪所产仔猪腹率为2.94%,而未免疫对照组的腹泻率为29.4%,打分评价的综合腹泻指数显示复合疫苗组仔猪腹泻程度要远远低于对照组,各实验组与对照组比较均差异极显著(p<0.01)间接ELISA试验检测复合疫苗组母猪血清和乳清中特异性抗体含量,结果显示在一免、二免后血清中特异性抗体效价持续上升,抗F4菌毛抗体效价最高可达1：10000,抗F5菌毛抗体效价最高可达,1：8000,抗重组肠毒素抗体效价最高可达1：16000,同时产后三天内乳清中抗F4菌毛抗体效价为1∶8000,抗F5菌毛抗体效价为1∶6000,抗重组肠毒素抗体效价为1∶12000。研究结果表明,本研究制备的重组三价肠毒素及菌毛多价复合疫苗具有较好的疫苗保护效果,为本疫苗将来的广泛应用提供了很好的实验依据。