【摘 要】
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该研究采用巴氏毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K实现了野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因在巴氏毕赤酵母GS115中的表达和分泌.从质粒pB16中以PCR方法扩增出去除5端的信号肽序列的野油
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该研究采用巴氏毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K实现了野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因在巴氏毕赤酵母GS115中的表达和分泌.从质粒pB16中以PCR方法扩增出去除5端的信号肽序列的野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因,将PCR产物以EcoRI位点克隆到大肠杆菌克隆质粒载体pBluescript(KS)上,构建成中间载体pKSXA.从中间载体pKSXA上用EcoRI将α-淀粉酶基因片段切下来,并与EcoRI消化的Pichia pastoris分泌表达载体Ppic9K连接,构建成α-淀粉酶基因表达质粒pPICXA.以SalI从his4基因间切断以线性化pPICXA,得到的线状DNA用电转化的方法导入Pichia pastoris GS115,筛选His<+>,表型的重组菌株,得到重组菌GSXA.在YPMSP平板上的生长显示：GSXA表现出明显的分泌性的淀粉水解酶活,性而GS115没有这样的活性.用早醇诱导GSXA摇瓶培养液的酶活测定结果进一步证实了α-淀粉酶基因在重组酵母GSXA中的表达和分泌.以野油菜黄胞菌α-淀粉酶基因为模板进DNA Shuffling实验,通过DNaseI消化、一轮无引物的PCR和一轮有引物的PCR最终能得到一条与出发基因大小相当的特异性条带.
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