Stra8 (stimulated by retinoic acid gene8)是一种视黄酸(retinoic acid,RA)反应基因,在成年小鼠睾丸中特异性表达,同时其蛋白在睾丸中的表达具有阶段利细胞特异性。Stra8对于精子发生的过程是至关重要的。Stra8基因敲除的雄性小鼠不育,精子发生过程受到严重影响。本实验室在前期工作中以Stra8蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术从小鼠精原干细胞cDNA文库中筛选与Stra8目互作用的蛋白,结果发现一个新的与Stra8相互作用的蛋白-Setd8蛋白。Setd8是现今发现唯一能够特异性单甲基化H4K20的赖氨酸甲基转移酶,在许多生理过程中发挥着重要作用,但目前为止未见在生精细胞中的研究。本研究主要探讨精子发生相关蛋白Stra8与Setd8的相互作用机制,为以后进一步研究Stra8与Setd8在精子发生中的作用机制提供理论基础。第一,利用双荧光素酶报告基因实验,明确Stra8与Setd8能够相互转录调控。(一)Setd8对Stra8的转录调控分析。构建含有Stra8启动子的重组质粒pGL3-Stra8Pro,与pRL-CMV共转染到293T细胞中,检测荧光素酶活性,确定Stra8启动子有转录活性。然后用空载pCMV-HA、pCMV-HA-Setd8分别与pGL3-Stra8Pro共转染至293T细胞,通过检测荧光素酶活性,确定Setd8蛋白能够抑制Stra8启动子转录活性。此外,我们在上述系统中加入0、0.0625μg、0.125μg、0.25μg和0.5lμg不同含量的pCMV-HA-Setd8,结果发现,不同含量的Setd8蛋白对Stra8启动子活性无显著影响。(二)Stra8对Setd8的转录调控分析。构建含有Setd8不同长度启动子的重组质粒pGL3-Setd8Pro,分别与pRL-CMV共转染到293T细胞中,检测荧光素酶活性,确定Setd84种不同长度启动子均有转录活性,其中在Setd8 mRNA上游-1499-+1bp的启动子转录活性最强。因此我们选择pGL3-Setd8ProF2R用于后续实验。然后用空载pCMV-Myc、 pCMV-Myc-Stra8分别与pGL3-Setd8ProF2R共转染至293T细胞,通过检测荧光素酶活性,确定Stra8蛋白能够增强Setd8启动子转录活性。此外,我们在上述系统中加入0、0.0625μg、 0.125μg、0.25μg和0.5gg不同含量的pCMV-Myc-Stra8。结果发现,当加入的蛋白量达到0.25μ,g时,能显著增强Setd8启动子转录活性。第二,Stra8与Setd8相互作用位点分析。(一)根据Setd8含有的结构域,构建含有五种不同长短的Setd8截短片段的pGADT7重组质粒。将Setd8全长、五种截短片段和Setd8NO.50(81-286aa)分别与pGBKT7-Stra8片段共转化至酵母菌株AH109中,并在营养缺陷型培养基SD/-LTAH/X-α-gal中培养。结果显示：Setd8全长以及构建的五个Setd8截短片段,均不能与Stra8片段相互作用,而Setd8NO.50 (81-286aa)与Stra8片段能够相互作用。(二)构建Setd8F1R1(全长)及4种不同长短的Setd8截短片段的真核表达重组质粒。构建完成后瞬时转染至293T细胞中验证其表达。结果发现,这五种重组质粒蛋白都能正确表达。将构建的重组质粒、pCMV-HA-Setd8NO.50分别与pCMV-Myc-Stra8全长共转染至293T细胞中,在293T细胞总蛋白中用鼠抗C-Myc进行免疫共沉淀,用兔抗HA进行Western Blot分析。结果表明,只有Setd8NO.50能够与Stra8目互作用,其余的重组质粒都没有相互作用。第三,利用免疫共沉淀确定Setd8与Stra8相互作用的关键区域。构建3种不同长短的Stra8截短片段的真核表达重组质粒。构建完成后瞬时转染至293T细胞中验证其表达。结果发现,这三种重组质粒只有一种能正确表达蛋白,其余两种不表达蛋白。然后将能正确表达蛋白的质粒与pCMV-HA-Setd8全长共转染至293T细胞中,在293T细胞总蛋白中用鼠抗C-Myc进行免疫共沉淀,用兔抗HA进行Western Blot分析。结果表明,构建的Stra8截短片段与Setd8全长没有相互作用。第四,Stra8过表达对生精细胞的增殖和凋亡的影响。(一)利用SRB细胞增殖实验研究Stra8稳定过表达的精原细胞株Stra8-GC1与对照组Control-GC1在细胞增殖上是否有差异。根据细胞计数使得起始细胞数相同,分别在铺板后4h (day0)、day1、day2、day3、day4、day5时间点收集细胞,绘制生长曲线。由结果可知,每个对应时间点OD值均无统计学差异。说明Stra8对体外培养的精原细胞增殖无明显影响。其次,我们利用流式细胞仪对上述细胞进行了细胞周期的检测,结果表明,Stra8过表达对精原细胞细胞周期的影响无统计学意义(P>0.05),与SRB增殖实验的结果相吻合。综上结果说明Stra8对体外培养的精原细胞的分裂增殖无明显影响。(二)Stra8过表达对生精细胞凋亡的影响。利用PI/AnnexinV双标记检测Stra8-GC1和Control-GC1在正常培养状态下凋亡的发生率。结果发现,Stra8-GC1的早期凋亡率比Control-GC1的早期凋亡低,且具有统计学意义(P<0.05)。第五,同步化Stra8过表达细胞,检测细胞周期不同时期Stra8和Setd8 mRNA水平。(一)经过实验方法的优化,最终用无血清的DMEM培养Stra8-GC1细胞3天后,G0/G1期比例在60%以上；利用胸苷处理细胞20h后,S期比例能达到65%。利用诺考达唑处理8h后,将细胞阻滞在G2/M期。使用“拍打”的方法收集细胞。G2/M期比例达到90%以上,纯度较高。(二)利用RT-PCR检测上述同步化方法后的细胞周期不同时期Stra8和Setd8 mRNA水平。结果发现,在Stra8-GC1细胞中,Stra8和Setd8 mRNA水平在G0/G1期最低,至S期逐渐升高,Setd8 mRNA水平在G2/M期保持不变,而Stra8有一定的下降。通过上述研究,我们明确了Stra8和Setd8能够相互进行转录调控。Stra8与Setd8蛋白能够相互作用,但其相互作用机制有待进一步研究。Stra8对体外培养的生精细胞的增殖没有明显影响,而Stra8稳定过表达的精原细胞早期凋亡率比对照组低。Stra8和Setd8 mRNA水平在精原细胞不同的细胞周期时相中表达具有一定的规律性。这些研究为以后进一步研究Stra8与Setd8在精子发生中的作用提供了理论基础。