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柑橘红肉突变体果实富含多种对人体有益的类胡萝卜素。这些突变体不仅能为研究柑橘芽变形成,而且还对研究柑橘果实类胡萝卜素代谢提供素材。本研究以甜橙红肉突变体红肉脐橙(C.sinensis Osbeck)和红色暗柳橙(C.sinensis Osbeck)为实验材料,分析了其果实发育过程中类胡萝卜素变化趋势和相关基因的表达;并构建了红肉脐橙果肉cDNA文库,开发了部分EST。主要研究结果如下: 1、完善了柑橘成熟果肉的RNA提取方法。发现在RNA提取过程中,先用无水乙醇去除果肉中的水分,能获得高纯度和高浓度的RNA样品。 2、对红肉脐橙和华盛顿脐橙8-11月份的果实类胡萝卜素总量和组分变化进行了分析。结果表明:红肉脐橙果实中类胡萝卜素总量、番茄红素和八氢番茄红素比华盛顿脐橙高。红肉脐橙果肉中β-胡萝卜素含量要高于华盛顿脐橙,但后者果皮α-胡萝卜素含量比红肉脐橙高。 3、克隆并分析了红肉脐橙与华盛顿脐橙果实发育过程中类胡萝卜素合成途径9个相关基因。结果表明: 1) 红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素β环化酶基因(Lcyb)均为单拷贝等位基因,有2个不同的转录本,这2个转录本之间有差异,但品种间没有差异。mRNA原位杂交和RT-PCR分析表明,Lcyb表达量随果实成熟上升,但在红肉脐橙白皮层中没有表达或表达量很低。 2) 红肉脐橙和华盛顿脐橙八氢番茄红素合成酶基因(Psy)均为2个拷贝,两者推导的氨基酸只有1个残基的差异。其表达量随着果实成熟而上升,但红肉脐橙白皮层中Psy基因的表达量要比华盛顿脐橙高。 3) 红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素ε环化酶基因(Lcye)为单拷贝基因。在果实发育过程中均发生了选择性剪接,形成两个转录本,其中一个转录本缺失14bp产生终止突变。包含缺失区的DNA含有2个6bp的正向重复。 4) 牻儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(Ggps)、β-胡萝卜素羟化酶基因(Bch)等另外6个基因在红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中均有表达,但番茄红素上游基因表达量要比下游基因高。对这6个基因的拷贝数分析表明,红肉脐橙和华盛顿脐橙没有差异。 4、采用cDNA-AFLP研究了红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中差异表达基因。通过120对引物组合扩增,获得了1个在红肉脐橙果肉中增强表达的片断,并