小RNA病毒科目前包含有17个病毒属如口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、肠病毒属（Enterovirus）、鼻病毒属（Rhinovirus）和肝病毒属（Hepatovirus）等。病毒无包膜，正二十面体球形结构。病毒衣壳蛋白由VP1，VP2，VP3，VP4等4个结构蛋白所组成。该病毒科较常见的高致病病毒包括Enterovirus71（EV71）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）和甲肝病毒（HepatitisAvirus，HAV）等。EV71和柯萨奇病毒如柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus，CVA16）的感染可诱发手足口病、脑干脑炎和脑膜脑炎等多种严重疾病。而脊髓灰质炎病毒和甲肝病毒的感染可分别导致脊髓灰质炎和甲型肝炎等严重疾病。目前，EV71和CVA16病毒还没有疫苗来预防其感染。而脊髓灰质炎病毒和甲肝病毒虽分别有减毒和灭活型预防性疫苗，但减毒的脊髓灰质炎疫苗具有可引起疫苗相关麻痹性脊髓灰质炎的缺陷，而灭活的脊髓灰质炎疫苗和甲肝疫苗则因成本高而极大地限制其广泛的应用。随着现代生物技术的快速发展，基因工程疫苗成为了近年来新型病毒预防性疫苗主要的发展趋势。其中，基于病毒样颗粒的基因工程疫苗因病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）具有与天然病毒衣壳蛋白相似或相同的空间构型及抗原表位且不含病毒的基因组，而且具有完整的免疫原性和较高的安全性而备受关注。本研究开展了针对小RNA病毒科的几类常见的高致病的病毒如EV71、CVA16、脊髓灰质炎病毒和甲肝病毒的病毒样颗粒的制备技术的研究。探索了利用现代分子生物学技术制备预防上述4种病毒的基于病毒样颗粒的基因工程疫苗的新方法。本课题利用酿酒酵母表达系统来制备4种病毒的VLPs。酵母表达系统是大规模生产表达重组蛋白的理想模式。具有成本低，产量高等特点。我们首先对EV71的结构蛋白P1基因和蛋白酶3CD基因进行了密码子优化，使其能够高效利用酿酒酵母自身的翻译系统，利用分子克隆技术构建了共表达P1和3CD基因的表达载体，将表达载体通过化学法转至酿酒酵母胞内，诱导外源蛋白的表达，收获并破碎菌体后，通过密度梯度离心对发酵产物进行了初步纯化，通过Western Blot检测了EV71蛋白的表达，通过透射电镜观测到与真实病毒大小一致的EV71VLPs。为了验证表达载体质粒是否能在酿酒酵母胞内稳定存在，我们还通过Real-TimePCR法对质粒拷贝数的稳定性进行了检测，实验结果表明，在酿酒酵母培养及诱导过程中，质粒表达载体丢失率较低。为了提高EV71VLPs的表达量，接下来，我们还对酿酒酵母表达系统的培养条件进行了优化，延长酿酒酵母的对数生长期并使其菌密度显著提高，实验结果表明优化培养条件后，收获的酿酒酵母菌量比未优化前增加了30%，并且EV71VLPs的表达量有了明显的提高。此外，我们还对CVA16，Poliovirus I型的结构蛋白P1和蛋白酶基因进行了优化，构建了CVA16及Poliovirus I的酿酒酵母表达载体，诱导表达、收获纯化后，通过透射电镜和Westen Blot鉴定，表明了酿酒酵母表达系统同样成功表达并组装形成了CVA16及Poliovirus I型的VLPs。我们还尝试利用酿酒酵母表达系统表达未优化的HAV LA-1疫苗株的结构蛋白及蛋白酶，利用酿酒酵母表达系统，经过和以上病毒同样的培养及纯化过程，实验结果表明，未优化的HAV基因酿酒酵母胞内虽然成功组装形成了HAV VLPs，但产量较低，因此对目的基因进行密码子优化，对于其是否能高效表达是十分必要的。在以上实验的基础上，我们还对EV71VLPs的免疫原性进行初步评价。用纯化后的EV71VLPs免疫小鼠BALB/c，肌肉注射，首次注射2周后加强免疫一针，通过检测血清中特异性IgG抗体的应答水平以及血清的中和抗体保护效力，表明EV71VLPs免疫诱导了机体产生了体液免疫。当用致死剂量的EV71病毒与VLPs免疫血清中和并对乳鼠进行攻击时，发现89％的乳鼠获得保护，其保护效力与BPL灭活处理的EV71病毒相当。结果表明EV71VLPs具有良好的免疫原性。本论文成功地在酿酒酵母系统中建立了表达EV71、CVA16、Poliovirus和HAV VLPs的方法，并对EV71VLPs的免疫原性进行了初步评价。结果表明酿酒酵母表达的EV71VLPs具有良好的免疫原性，可以诱导出中和EV71病毒的中和抗体，为预防小RNA病毒的新型疫苗的研究提供了新思路。