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第一部分RAR/MMP信号通路在肾小球硬化大鼠肾脏组织中的表达及ATRA干预目的:探讨维甲酸受体(retinoic acid receptors,RARs)/基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)信号通路在肾小球硬化大鼠肾脏组织中的表达,以及全反式维甲酸(all-trans retinoid acids,ATRA)干预对RAR/MMP信号通路表达的影响。方法:6周龄雄性Wistar大鼠(n=30)随机分为假手术组(SHO组,n=10),肾小球硬化模型组(GS组,n=10),GS模型给予ATRA干预组(ATRA组,n=10)。GS组和ATRA组大鼠经背侧行左侧肾脏切除术后双重结扎肾蒂造模,而SHO组背侧手术切口后仅探及左肾被膜。术后1周GS组和ATRA组给予尾静脉注射阿霉素(5mg/kg),SHO组给予等体积的生理盐水,1天后ATRA组开始给予ATRA灌胃(20mg/Kg·d),SHO组和GS组给予等量生理盐水灌胃。造模12周末处死各组大鼠并取肾组织,透射电子显微镜观察肾小球足细胞足突改变,切片进行HE染色检测肾脏组织病理变化并计算肾小球硬化指数(Glomerular sclerosis Index,GSI),应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferse-mediated nick end labeling,TUNEL)检测肾小球细胞凋亡情况,用免疫组织化学方法检测肾脏组织维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)、维甲酸受体β(retinoic acid receptorβ,RARβ)、维甲酸受体γ(retinoic acid receptorγ,RARγ)、MMP2、MMP9、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、IV型胶原(collagen-IV,Col-IV)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及nephrin的蛋白表达,应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应法(real-time fluorescent quantitative polymerase chainreaction,RT-PCR)检测肾脏组织RARα、RARβ、RARγ、MMP2、MMP9、TGF-β1及nephrin的m RNA表达,提取肾小球并用Western blot(WB)法检测肾小球RARα、RARβ、RARγ、MMP2、MMP9、TGF-β1及nephrin蛋白表达。结果:1.与SHO组比较,电镜下GS组肾小球足细胞可见广泛的足突微绒毛样变融合或消失,肾小球基底膜上被一层细胞质覆盖;与GS组比较,ATRA组可见部分足细胞足突节段性融合消失。2.与SHO组比较,光镜下GS组肾小球内球囊粘连,囊壁增厚,内皮细胞和系膜细胞高度增生,基质增多,部分严重增生导致肾小球毛细血管腔狭窄或闭塞,形成肾小球局灶节段性硬化,肾小管呈多灶状萎缩和代偿性肥大,多数管腔扩张,可见大量蛋白管型,肾间质可见大量炎症细胞浸润,GSI显著增加(P<0.05);与GS比较,ATRA组可见肾小球部分球囊粘连,内皮细胞和系膜细胞增生不明显,肾小球毛细血管腔狭窄或闭塞较轻,肾小管萎缩不显著,GSI显著降低(P<0.05)。3.与SHO组比较,GS组肾小球细胞凋亡指数显著增高(P<0.05);与GS组比较,ATRA组肾小球细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。4.与SHO组比较,GS组大鼠肾脏组织RARα、RARγ、nephrin、MMP2及MMP9的m RNA表达均显著降低(均P<0.05),TGF-β1的m RNA表达显著增加(P<0.05),而RARβ的m RNA表达无显著差异(P>0.05);与GS组比较,ATRA组大鼠肾脏组织RARα、RARγ、nephrin、MMP2及MMP9的m RNA表达均显著增加(均P<0.05),TGF-β1的m RNA表达显著降低(P<0.05),而RARβ的m RNA表达无显著差异(P>0.05)。5.与SHO组比较,GS组大鼠肾小球RARα、RARγ、nephrin、MMP2及MMP9的蛋白表达均显著降低(均P<0.05),TGF-β1、Col-IV、FN的蛋白表达均显著增加(均P<0.05),而RARβ的蛋白表达无显著差异(P>0.05);与GS比较,ATRA组大鼠肾小球RARα、RARγ、nephrin、MMP2及MMP9的蛋白表达均显著增加(均P<0.05),TGF-β1、Col-IV、FN的蛋白表达均显著降低(P<0.05),而RARβ的蛋白表达无显著差异(P>0.05)。6.相关性分析:肾小球RARα和RARγ的蛋白表达与GSI、肾小球细胞凋亡指数、肾小球TGF-β1、Col-Ⅳ、FN的蛋白表达均呈显著负相关(均P<0.05),与MMP2、MMP9、nephrin的蛋白表达均呈显著正相关(均P<0.05);肾小球RARβ蛋白表达与GSI、肾小球细胞凋亡指数、肾小球TGF-β1、Col-Ⅳ、FN、MMP2、MMP9、nephrin的蛋白表达均无显著相关性(均P>0.05)。结论:RARα/γ表达降低可能参与了大鼠GS的发生发展;ATRA可减轻大鼠GS进展,其机制可能是通过RARα/γ上调MMP2/9表达,从而降低TGF-β1及ECM表达、增加nephrin表达以减轻GS。第二部分ATRA通过RAR/MMP信号通路减轻足细胞损伤的分子机制目的:通过沉默体外培养足细胞RARα、RARβ、RARγ的表达,探讨ATRA通过RAR/MMP信号通路减轻阿霉素致足细胞损伤的分子机制。方法:构建Rara-RNAi、Rarb-RNAi、Rarg-RNAi、阴性对照CON077慢病毒载体并对体外培养足细胞MPC5进行转染,转染成功后应用RT-PCR及WB法对各转染组进行转染效率筛选及验证。因基因干扰实验需分7组:空白对照组(NC组)、ADR组、ATRA组、RARα(-)组、RARβ(-)组、RARγ(-)组、阴性病毒对照组。阿霉素致足细胞损伤模型:足细胞贴壁铺满孔底后更换含0.15μg/ml阿霉素的完全培养基孵育24h;ATRA干预:阿霉素孵育24h后更换含有0.1μM/ml ATRA的完全培养基孵育24h;实验分组中,NC组不做干预正常培养,ADR组经阿霉素造模后更换正常培养基,ATRA组、RARα(-)组、RARβ(-)组、RARγ(-)组、阴性病毒对照组先经过阿霉素造模后给予ATRA干预,24h后收集各组细胞进行相关检测。光学显微镜及扫描电子显微镜观察足细胞形态改变,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定各组足细胞活性及增殖情况,流式细胞术检测各组足细胞凋亡率,RT-PCR检测各组足细胞RARα、RARβ、RARγ、TGF-β1、nephrin、MMP2、MMP9的m RNA表达,WB检测各组足细胞RARα、RARβ、RARγ、MMP2、MMP9的蛋白表达。结果:1.成功构建并筛选出沉默效率高的Si RNA-RARα、Si RNA-RARβ、Si RNA-RARγ慢病毒载体,成功转染足细胞。LV-Rara-RNAi转染组RARα的m RNA及蛋白表达水平较空载病毒组显著下降(P<0.05);LV-Rarb-RNAi转染组RARβ的m RNA及蛋白表达水平较空载病毒组显著下降(P<0.05);LV-Rarg-RNAi转染组RARγ的m RNA及蛋白表达水平较空载病毒组显著下降(P<0.05)。2.光镜及扫描显微镜下,NC组足细胞多边形、轮廓清楚、排列整齐,可见足突;与NC组比较,光镜下ADR组足细胞形态出现萎缩,部分细胞脱落,细胞碎片增多,足突融合甚至消失;与ADR组比较,ATRA组、RARβ(-)组和病毒阴性对照组足细胞萎缩、细胞碎片减少,可见由胞体延伸的初级次级足突结构,而RARα(-)组和RARγ(-)组萎缩明显,细胞碎片增多,未见明显延伸的足突。3.与NC组比较,ADR组足细胞增殖受到显著抑制作用(P<0.05);与ADR组比较,ATRA组和RARβ(-)组在ATRA干预后足细胞活性显著增加(均P<0.05),RARα(-)组和RARγ(-)组在ATRA干预后足细胞活性显著未见显著改变(均P>0.05);病毒阴性对照组与ATRA组相比无显著差异(P>0.05)。4.与NC组比较,ADR组足细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与ADR组比较,ATRA组和RARβ(-)组足细胞凋亡率显著降低(均P<0.05),RARα(-)组和RARγ(-)组足细胞凋亡率未见显著改变(均P>0.05);病毒阴性对照组与ATRA组足细胞凋亡率相比无显著差异(P>0.05)。5.与NC组比较,ADR组足细胞的RARα、RARγ的m RNA及蛋白表达均显著降低(均P<0.05)而RARβ的m RNA及蛋白表达均无显著差异(均P>0.05);与ADR组比较,RARα的m RNA及蛋白表达在ATRA组、RARβ(-)组、RARγ(-)组显著增加(均P<0.05)而在RARα(-)组显著降低(P<0.05),RARγ的m RNA及蛋白表达在ATRA组、RARα(-)组、RARβ(-)组均显著增加(均P<0.05)而在RARγ(-)组显著降低(P<0.05),RARβ的m RNA及蛋白表达在ATRA组、RARα(-)组、RARγ(-)组均无显著性差异(均P>0.05)而在RARβ(-)组表达显著降低(P<0.05);与ATRA组比较,病毒阴性对照组的RARα、RARβ、RARγ的m RNA及蛋白表达均无显著差异(均P>0.05)。6.与NC组比较,ADR组足细胞MMP2、MMP9的m RNA及蛋白表达和nephrin、podocin的m RNA表达显著降低(均P<0.05),TGF-β1的m RNA表达显著增加(P<0.05);与ADR组比较,ATRA组、RARβ(-)组的MMP2、MMP9的m RNA及蛋白表达和nephrin、podocin的m RNA表达显著增加(均P<0.05),TGF-β1的m RNA表达显著降低(P<0.05);与ADR组比较,RARα(-)组、RARγ(-)组的MMP2、MMP9的m RNA及蛋白表达和nephrin、podocin、TGF-β1的m RNA表达均无显著差异(均P>0.05)。7.相关性分析:足细胞RARα、RARγ的蛋白表达与MMP2、MMP9的蛋白表达均呈显著正相关(均P<0.05),与细胞凋亡率显著负相关(均P<0.05);足细胞RARβ的蛋白表达与MMP2、MMP9的蛋白表达及细胞凋亡率均无显著相关(均P>0.05);MMP2和MMP9蛋白表达与足细胞凋亡率显著负相关(均P<0.05)。结论1.ATRA可能通过上调足细胞MMP2、MMP9的表达发挥减轻足细胞损伤的作用。2.ATRA可能是通过与RARα/γ结合而上调MMP2/9信号通路表达,促进细胞分化、维持细胞活力、抑制细胞凋亡从而减轻足细胞的损伤。