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葡萄酒发酵过程十分复杂,涉及不同酵母属、种之间此消彼长的变化,且酵母菌的生长、代谢和相互作用都会显著影响葡萄酒的质量。氮源是影响酵母菌生长和代谢的关键营养物质之一。本研究在四个可同化氮(Yeast Assimilable Nitrogen,YAN)浓度水平的模拟汁中,研究了我国本土优良酵母和商业酵母的发酵特征,旨在探究优选酵母菌的YAN利用模式。在此基础上对优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NX11424与商业酵母UCD522 HO::Kanmx和UCD2610 HO::Kanmx在混合发酵(接种比例为1:1)中的数量动态变化进行监控,以期为研究混合发酵中酵母菌代谢互作奠定基础。最后,利用代谢组学技术对NX11424、UCD522 HO::Kanmx及二者混合发酵过程中的胞内及胞外代谢物进行全面分析,确定NX11424的代谢特征,及其与商业菌株间的代谢相互作用规律。为进一步控制和改善酒精发酵,提高葡萄酒质量奠定基础。主要研究结果如下:1.供试的8株S.cerevisiae和2株non-Saccharomyces(Hanseniaspora uvarum及Issatchenkia orientalis)在四个YAN(433 mg/L、208 mg/L、123 mg/L和55 mg/L)浓度下的发酵特征研究。在各个YAN浓度下,S.cerevisiae均可完成酒精发酵。相同YAN浓度下,S.cerevisiae的发酵速度最快,I.orientalis次之。此外,S.cerevisiae的发酵曲线(CO2累积释放量表示)在相同的YAN浓度下存在菌株差异性。YAN浓度为55 mg/L时,供试S.cerevisiae菌株的发酵速度差异最明显,UCD522(Montrachet)的发酵速度最快,我国本土S.cerevisiae LFE1225和NX11424次之,而UCD2610(EC1118)的发酵速度最慢;YAN浓度为433 mg/L时,供试菌株间的发酵速度差异最小。2.抗药性标记重组菌株的构建及混合发酵特征研究。(1)成功构建了具有抗药性标记的重组菌株UCD522 HO::Kanmx、UCD2610 HO::Kanmx和UCD2610HO::Hyg。在高(433 mg/L)、低(55 mg/L)两个YAN浓度下的发酵中,重组菌株与相对应的原始菌株的发酵速度、细胞数量及变化趋势基本一致。(2)NX11424与UCD522 HO::Kanmx或UCD2610 HO::Kanmx的混合发酵:高YAN发酵组中,NX11424在混合发酵中的数量占优势,对混合发酵的贡献较持久;低YAN发酵组中,NX11424与UCD522 HO::Kanmx或UCD2610 HO::Kanmx的细胞数量比例均为1:1左右,但在发酵末期比例略有提高。3.本土S.cerevisiae NX11424的代谢特征研究。(1)NX11424发酵不同阶段的关键差异代谢物,在高、低两个YAN浓度下的发酵中呈相似的变化。随着发酵的进行,伴随大量葡萄糖、肌醇、氨基酸等物质的摄入与利用,使甘氨酰脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、1-脱氧-赤藓糖醇和2-脱氧-赤藓糖醇等代谢物在胞内累积,并对甘油、海藻糖、琥珀酸、2,3-丁二醇等重要代谢副产物进行合成与分泌。(2)YAN浓度影响NX11424的代谢物水平,葡萄糖、丙酮酸、α-酮戊二酸、棕榈油酸、脯氨酸、2,3-丁二醇、瓜氨酸、鸟氨酸、肌醇半乳糖苷、2-甲基苹果酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸、磷酸盐和苯乙醇等代谢物的水平在高、低YAN两组发酵中的差异显著,主要涉及中心碳代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢和能量代谢等途径。NX11424在低YAN发酵组中可以利用脯氨酸进行蛋白合成;而在高YAN发酵组中,其胞内的瓜氨酸和鸟氨酸水平较高。NX11424更适合较低YAN水平下的发酵。4.低YAN浓度下,NX11424与UCD522 HO::Kanmx的胞内代谢差异研究。(1)二者的胞内代谢物水平在发酵的各个时期均存在显著差异,主要表现在14种关键差异代谢物上。NX11424发酵中具有较高水平的棕榈油酸、甘油-3-半乳糖苷、α-甘油磷酸、双甘油、肌苷、甘氨酰脯氨酸和苯丙氨酸,而UCD522 HO::Kanmx发酵中具有较高水平的磷酸乙醇、赤藓糖醇、肌醇半乳糖苷、胞苷酸、琥珀酸、苹果酸和2-异丙基苹果酸。(2)代谢通路分析表明,二者的甘油脂代谢,柠檬酸循环,戊糖、葡萄糖醛酸转换途径,氮代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,嘧啶代谢以及丁酸代谢等9条代谢途径存在显著差异(P<0.05)。随着发酵的进行,NX1124与UCD522 HO:Kanmx的代谢途径差异由碳代谢途径向氨基酸代谢和氮代谢途径转变。5.高、低两个YAN浓度下,NX11424、UCD522 HO::Kanmx及二者混合发酵不同阶段(2 d、4 d和6 d)的代谢物和代谢通路比较。(1)从整体上看,各发酵第2 d的胞内代谢物与第4 d及6 d的相比存在显著差异,而后两者之间的差异不显著。(2)对于不同菌株而言,发酵第2 d的胞内代谢物差异最显著。与单菌发酵相比,低YAN浓度下的混合发酵中的胞内氨基酸和TCA循环相关的代谢物水平降低,脂肪酸水平升高;而高YAN浓度下的混合发酵中的胞内TCA循环相关代谢物水平降低,氨基酸和EMP途径相关代谢物水平升高。代谢通路分析表明混合发酵能引起多个代谢途径发生显著变化(P<0.05),S.cerevisiae在低YAN浓度下通过协调多种类型的代谢途径来应对菌株间的竞争。低YAN浓度下,甘油脂代谢,柠檬酸代谢以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等9条代谢途径发生显著变化。高YAN浓度时,精氨酸和脯氨酸代谢,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢以及氮代谢等8条代谢途径发生显著变化。(3)发酵第6 d的胞外代谢物分析表明,高、低两个YAN浓度下,混合发酵组的代谢物都与NX11424更接近。对比高、低YAN组的混合发酵时发现,低YAN组中的酪醇、苯乙醇、甘油、2,3-丁二醇和琥珀酸等代谢副产物的水平高于高YAN发酵组。