论文部分内容阅读
纤维质降解酶在食品、造纸等领域具有广阔的应用,一直受到广泛关注。樟绒枝霉是一株性质优良的菌株,能利用纤维质材料分泌多种纤维质降解酶。本文主要针对该菌木聚糖酶的发酵条件、纯化、性质和应用进行研究。同时,探讨三种耐热木聚糖酶耦合高温蒸煮水解稻草制备低聚木糖的方法,论文主要结论如下：(1)采用响应面法优化樟绒枝霉S168液体发酵产木聚糖酶的条件。首先通过单因素试验确定该菌发酵最适碳源和氮源,然后利用Plackett-Burman设计筛选出对产木聚糖酶影响最显著的3个因素,最后用Box-Behnken设计确定了该菌最佳产木聚糖酶的条件。经优化,S168产木聚糖酶活力最高为646.0U/mL,相比优化前最高值(156.3U/mL)提高了3.14倍。(2)从樟绒枝霉S168发酵液中纯化得到一分子量为31.6kDa的木聚糖酶,命名为McXyn32,该酶为GH10家族木聚糖酶。McXyn32最适pH为MOPS7.0,在较宽广的pH范围内稳定；最适反应温度为70℃,且具有较好的热稳定性。该酶具有严格的底物特异性,只对木聚糖有活性,其水解木聚糖产物以低聚木糖为主,在低聚木糖制备中具有一定的应用价值。(3)从樟绒枝霉S168发酵液中纯化得到另一木聚糖酶,分子量为43.5kDa,命名为McXyn44。采用ESI-Q-TOF2测得该酶8个肽段序列,其中7个肽段与GH10家族木聚糖酶肽段相似性较高,1个则没有相似的木聚糖酶肽段,表明该酶为一个较新的GH10家族木聚糖酶。McXyn44最适pH为6.5,最适温度为80℃;该酶在pH3.5-10.5范围内稳定,在70℃保温30min仍有90%以上活力,具有较好的温度稳定性。McXyn44仅对木聚糖有活性,水解木聚糖主要产生低聚木糖,具有很好的工业应用前景。根据肽段GGDWAN和YYNDYNIEH设计引物,以S168总DNA为模板,得到保守基因片段；分别通过hiTAIL-PCR和SMARTRACE得到5’端和3’端基因,拼接后得到McXyn44全长基因。该基因cDNA3’端和5’端分别含有210bp和103bp非翻译区,开放阅读框为1191bp,编码396个氨基酸,N端信号肽为1-19氨基酸残基；成熟的蛋白质预测分子量为40kDa,等电点为4.37,与来源于Malbranchea pulchella的GH10家族木聚糖酶同源性最高(99%)。(4)对不同耐热木聚糖酶耦合高温蒸煮水解稻草制备低聚木糖进行了研究。利用樟绒枝霉木聚糖酶McXyn25酶解稻草高温蒸煮液,产物主要为木三糖和木二糖,低聚木糖得率为7.7%。利用嗜热拟青霉木聚糖酶PtXynA酶解高温蒸煮处理的稻草,产物也主要是木三糖和木二糖,低聚木糖得率和转化率分别为8.7%和51.2%。利用海栖热袍菌木聚糖酶XynBop耦合高温蒸煮强酸性电解水处理稻草,也主要产生木三糖和木二糖,低聚木糖得率为10.8%；该酶耦合高温蒸煮蒸馏水处理稻草时,主要产物为木二糖,通过活性炭色谱纯化,得到纯度为93.7%的木二糖。