论文部分内容阅读
2006年，我国爆发了高致病性猪蓝耳病(High pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome，HP-PRRS)。表现为不同年龄和体重的猪都能感染，以体温升高、皮肤发红和呼吸急促等为主要临床症状。剖检变化以弥漫性、出血性间质性肺炎、淋巴结和各内脏器官不同程度出血为突出特征。仔猪发病率达100％，死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，对我国养猪业造成了空前的影响和损失。
PRRSV是单股正链RNA病毒，基因组全长15Kb，含有8个开放阅读框架(ORFs)。其中，ORF7编码病毒的核衣壳蛋白(N)是病毒的主要结构蛋白，免疫原性强且在型内高度保守。猪感染PRRSV早期产生的抗体主要针对N蛋白，N蛋白在两型毒株中具有共同的抗原位点，以N蛋白为抗原，可检出病毒产生的特异性抗体，具有重要的诊断价值。
本实验根据Genbank上公布的PRRSV美洲型毒株VR-2332株的基因序列，设计了N基因的特异性引物P1/P2，利用RT-PCR扩增出HP-PRRSV的ORF7基因片段，将扩增的目的片段克隆入pET-28a、pGEX-4T-1载体并测序。测序结果表明，ORF7基因全长372bp，包含完整的开放阅读框架，编码123个氨基酸。序列分析结果表明，ORF7基因核苷酸序列与16个美洲型株的同源性为94.1％～99.5％，而与欧洲型(LV)的同源性仅为65.6％。系统发育进化树表明，所研究的高致病性猪蓝耳病毒株仍然属于美洲型，与高致病性PRRSV毒株GD、JXA1、HUN4、LN、TJ、HEB1、HuB1、HuB2、HuN、JX1、SD-ZQ、SHH亲缘关系较近。
将己构建得重组质粒pET-ORF7转化入宿主菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE分析表明，在17kDa处出现了目的条带。确立了最适诱导表达条件为IPTG1mM、28℃作用4h。目的蛋白的分析表明表达产物主要以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。经Bandscan5.0软件分析表明，可溶性蛋白含量占菌体总蛋白的22.2％。在非变性条件下应用Ni-NTA His·Bind树脂层析对重组表达蛋白进行纯化，Western blotting分析结果显示，纯化蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应，说明纯化的蛋白具有良好的免疫活性。