论文部分内容阅读
研究背景：炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)作为一种病因及发病机制尚未完全明确的,以累及肠道为主的消化道慢性炎症性疾病,在临床上一般包括克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)作为最早被人工分离出的成体干细胞,具有许多生物学特点和优势,如：自身低免疫原性、多向分化潜能、免疫调节作用、取材方便等,因此成为临床上移植疗法的推荐选择之一,对IBD而言,因其可通过促进病变肠黏膜修复并纠正机体及局部的免疫功能紊乱,而成为治疗本病的首选细胞。然而,经静脉移植的BMMSCs最终定植于病变肠黏膜的数量有限,限制了其治疗作用的发挥。由于干细胞的归巢行为涉及多种趋化因子及其受体的参与,其中趋化因子CXC亚组受体-4/基质细胞衍生因子-1(Chemokine Receptor-4/Stromal cell-derived Factor-1,CXCR4/SDF-1)的作用已经被证实在介导干细胞归巢中发挥着十分重要的地位。故利用CXCR-4基因转染BMMSCs,能够使其在体内的靶向性定位增强,从而提高疗效。实验目的：通过移植未经修饰的BMMSCs和CXCR-4基因修饰的BMMSCs来比较两者在治疗实验性IBD小鼠模型中肠道黏膜局部定植率及疗效,并探讨CXCR-4基因修饰的BMMSCs促进受损肠黏膜愈合的机制,从而为临床上确定一种选择靶向性更强的干细胞用于治疗IBD提供理论依据。实验内容：1、构建并鉴定BMMSCs。2、构建并鉴定经CXCR-4基因修饰的靶向性BMMSCs及评估其体外迁移率。3、观察经CXCR-4基因修饰的BMMSCs能否向IBD小鼠损伤肠黏膜定向迁移并加快其愈合。4、探讨靶向性BMMSCs通过何种机制在肠道局部大量定植并发挥修复作用。实验方法：1、采用细胞贴壁分离法从雄性BALB/c小鼠(4-5周龄)的骨髓中分离并体外培养BMMSCs;并对BMMSCs进行荧光染料(CM-Dil)标记。2、通过形态学观察、流式细胞学技术检测细胞表面标志物、成骨／成脂肪样细胞诱导分化实验对所培养的BMMSCs进行鉴定。3、将携带CXCR-4的慢病毒转染入BMMSCs构建成CXCR4-BMMSCs;进行嘌呤霉素筛选实验,从中提纯CXCR-BMMSCs;采用Real time-PCR检测并比较转染组和未转染组的CXCR-4的表达量。4、通过形态学观察、流式细胞技术检测细胞表面标志物、成骨／成脂样细胞诱导分化实验、台盼蓝拒染实验间接测定细胞存活率、流式细胞学测定细胞周期,来比较两组生物学特性的差异。5、通过Transwell体外迁移实验,比较两组细胞向SDF-1的迁移率。6、选择雌性BALB/c小鼠(6-8周龄),分别随机分为6组;①对照组(标记为Control, Ctr组)：生理盐水灌肠(0.1m1/只),灌肠后第2天,给予尾静脉注射不含BMMSCs的PBS 0.1ml, n=20; ②TNBS组(T组)：TNBS-乙醇灌肠剂(0.1m1/只),并于造模后第2天,给予尾静脉注射不含BMMSCs的PBS 0.1ml,n=20;③ BMMSC移植组(MT组)：TNBS-乙醇灌肠剂(0.1ml/只),并于造模后第2天,尾静脉注射含BMMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml,n=20;④CXCR-BMMSC移植组(CMT组)：TNBS-乙醇灌肠剂(0.1ml/只),并于造模后第2天,给予尾注射含CXCR4-BMMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml,n=20。移植当天标记为D0,移植后第1-13天,分别记为D1-13。7、观察各组小鼠一般情况、体重变化及存活率、进行临床症状评分、肉眼及放大镜下观察结肠大体外观、黏膜状况,进行组织病理学评分。8、分别于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13天采用颈椎脱臼法处死小鼠3只/组,并取材血液、肠道组织、肠系膜淋巴结及脾脏,一部分进行石蜡包埋,一部分经液氮速冻后,-80。C冰箱保存。9、荧光显微镜下观察各组细胞在肠道内的定植情况,应用Real time PCR检测并比较Y染色体的性别决定区段(SRY)基因的肠道局部的相对量。10、采用免疫组织化学检测肠道干细胞标志物Lgr-5、肠道上皮间的紧密连接蛋白Occludin、血管生成指标VEGF的表达情况。11、采用Western Blot技术检测P13K的表达情况。实验结果：1、采用贴壁分离法培养的BMMSCs随着不断纯化其细胞形态呈长梭状且按束状排列,细胞表型鉴定显示为：CD90.2+;CD105+;CD45-;CDllb-,成骨诱导可见明显的骨结节形成,成脂肪诱导可见脂滴。经荧光染料染色后对细胞的生物学特性无明显影响。2、将CXCR-4基因导入BMSCs后,与BMMSCs组比较可检测到CXCR-4基因的高表达(p<0.05)：3、CXCR-BMMSCs组细胞均呈长梭形并束状排列；细胞表型鉴定未发生改变(CD90.2+;CD105+;CD45-;CD11b-);成骨诱导可见明显的骨结节形成,成脂肪诱导可见脂滴；活细胞比率均在90%以上;以上结果与未经修饰的BMMSCs相比无明显差异(p>0.05);在细胞周期检测中发现过表达CXCR-4基因的BMMSCs处于复制期的细胞增多(p<0.05)。4、体外迁移实验证实：在SDF-1的诱导下，CXCR-BMMSCs组的迁移率>BMMSCs组(p<0.05)。5、TNBS-乙醇灌肠法诱导后的实验性IBD小鼠模型的存活率明显下降、小鼠精神状态差且体重明显下降,临床症状及组织病理学评分上升,肉眼观察可见结肠皱缩,局部肠段狭窄,肠黏膜伴有充血水肿、糜烂形成,黏膜及黏膜下层有大量中性粒细胞浸润,与正常组比较均有明显差异(p<0.05)；MT组、CMT组移植后第2天,与T组相比,存活率开始上升,疾病症状减轻、体重回升,临床症状及组织病理学评分下降(p<0.05), CMT组诱导缓解的效果更好(p<0.05)。6、荧光显微镜下可见MT组、CMT组的肠道组织均存在红色荧光;治疗组及雄性对照组的肠道黏膜组织中均能检测到SRY基因；体内定植率的比较显示CMT组>MT组。(p<0.01)7、免疫组织化学染色结果显示：IBD模型小鼠接受BMSCs移植后,肠道干细胞标志物Lgr-5、肠道上皮间的紧密连接蛋白Occludin及VEGF的表达量较造模未治疗组有所升高。8、Western Blot的结果显示：与T组相比,MT组、CMT组P13K的蛋白表达量均升高,其中CMT组升高最为明显(p<0.01)。实验结论：1、利用慢病毒载体转染CXCR-4基因至BMMSCs,几乎不会改变BMMSCs原有的生物学特性。2、体内外实验均证实了CXCR-4基因的过表达可增加BMMSCs的迁移率。3、通过干细胞移植治疗实验性IBD小鼠模型时,其治疗效果与细胞在肠道的定植率呈正相关,并且可通过促进肠道干细胞分化、重构肠上皮紧密连接、激活P13K信号通路来促进肠黏膜再生、修复、上皮屏障重建及血管生成。