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鲫（Carassius carassius）养殖成本低,且养殖地域较广,在中国淡水养鱼业的养殖规模越来越大,由于疱疹病毒性造血器官坏死病（herpesviral haematopoietic necrosis,HVHN）的暴发,给中国鲫鱼养殖业的可持续发展带来了严重的影响,鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）为该病的主要病原。因此,对于CyHV-2病毒的分离提纯、病毒结构蛋白等的鉴定以及建立有效的检测方法是必不可少的。目前,对于CyHV-2病毒的分离已有一些报道,但对于CyHV-2病毒的提纯的相关研究较少,不利于病毒形态的观察以及基因和蛋白的鉴定,通过质谱分析鉴定CyHV-2的结构蛋白和主要免疫原性蛋白可以为CyHV-2更深入的研究提供更多的理论依据。本实验室前期的研究得出,CyHV-2病毒的ORF121基因在患病鱼体内的组织以及血液中表达量较高,能够为CyHV-2病毒检测诊断技术的开发提供潜在的靶点,因此制备了抗CyHV-2-ORF121单克隆抗体,并从免疫学方面进行了鉴定分析。目前对于CyHV-2的比较成熟的检测方法已有多种,但是免疫学检测方法还相对较少,通过制备CyHV-2-ORF121蛋白的单克隆抗体和CyHV-2全病毒单克隆抗体,制备CyHV-2免疫检测试纸条,实现快速、灵敏和准确的检测CyHV-2。将通过制备单克隆抗体作为开发CyHV-2检测方法的研究方向是十分有潜力的。本研究分离提纯了CyHV-2病毒颗粒,通过质谱分析鉴定了CyHV-2的结构蛋白以及主要免疫原性蛋白;制备了抗CyHV-2-ORF121单克隆抗体和CyHV-2全病毒单克隆抗体,初步研制了CyHV-2免疫检测试纸条。研究主要包括以下三个方面:（1）利用本实验室保存的来自江苏盐城的感染CyHV-2的发病鲫鱼的组织研磨液（CyHV-2-YC01株）感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF）,收集大量细胞感染液,通过蔗糖密度梯度超速离心法对CyHV-2病毒颗粒进行纯化。病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色后,进行质谱鉴定。用纯化的病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体,经过Western-blot分析,质谱鉴定CyHV-2的鼠源的主要免疫原蛋白。结果表明,通过透射电子显微镜观察到了纯化的病毒颗粒,从50%～66%的蔗糖梯度中收集了大量完整的CyHV-2病毒颗粒,和少量囊膜破损的病毒颗粒。质谱鉴定结果表明,CyHV-2含有74个蛋白质,包括3个衣壳蛋白、18个膜蛋白、1个皮质蛋白、6个蛋白酶和46种未知蛋白;Western-blot分析和质谱鉴定结果表明,CyHV-2的八个主要的免疫原性蛋白包括ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。本研究首次鉴定了CyHV-2包含的结构蛋白及其主要免疫原蛋白,为CyHV-2的深入研究提供更为全面的理论基础。（2）用本实验室克隆的PGEX-4T-3-ORF121质粒进行诱导表达,对表达的蛋白进行纯化,用纯化后的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF121重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠的脾脏和SP2/0细胞进行细胞融合,采用Dot-blot法筛选阳性细胞株,对筛选的阳性细胞株进行Western-blot检测,利用筛选出的细胞株制备腹水,腹水经硫酸铵沉淀法纯化后进行效价检测,利用纯化的腹水检测感染CyHV-2的GiCF细胞和异育银鲫组织。结果显示,Dot-blot筛选出3D9细胞株为阳性最强的细胞株,Western-blot结果显示该抗体可以特异性识别CyHV-2纯化病毒粒子。且本研究制备的抗ORF121单克隆抗体可以检测感染CyHV-2的GiCF细胞,也能够检测到异育银鲫鳃、脑、心、肝脏、脾脏、肾脏等组织中的CyHV-2,且对CyHV-2具有一定的中和性。本研究制备的抗ORF121单克隆抗体能够为CyHV-2的检测方法的建立提供更多的技术支持。（3）用纯化的CyHV-2病毒粒子免疫小鼠,取免疫小鼠的脾脏与SP2/0细胞进行细胞融合,制备CyHV-2全病毒单克隆抗体,并对其功能进行分析,最终制备CyHV-2免疫检测试纸条。用Dot-blot法对融合细胞进行筛选,对筛选出的阳性细胞株进行Western-blot分析和抗体亚型检测;以及用筛选出的单克隆抗体通过免疫荧光检测感染CyHV-2的GiCF细胞;通过体外中和实验分析单抗对CyHV-2的中和性;利用Western-blot分析单抗与KHV的交叉性;最后用筛选出的单抗进行CyHV-2免疫检测试纸条的研制。结果表明:对Dot-blot筛选出的阳性细胞株进行转孔扩大培养,通过Western-blot检测筛选出五株能与CyHV-2有特异性反应的单克隆抗体,分别是3E11-H3、4F4-B7、3B4-B10、2E1-B10和2A6-E4。其中,对前三株进行了功能分析,其余两株2E1-B10和2A6-E4为近期新筛选到的抗体,只进行了亚型鉴定、Dot-blot与Western-blot检测,还未进行其他的功能分析。结果显示3E11-H3为ORF37R,Ig G3型,4F4-B7为ORF115,Ig M型,3B4-B10为双条带,Ig M型,2E1-B10,Ig G1型,2A6-E4,Ig G1型;通过免疫荧光检测感染CyHV-2的GiCF细胞结果显示:3E11-H3、4F4-B7和3B4-B10株抗体均能够检测到GiCF细胞中的CyHV-2,呈现典型的绿色荧光信号;体外中和实验显示这三株抗体对CyHV-2均有一定的中和性;用纯化的KHV病毒进行的交叉性分析,3E11-H3和4F4-B7与KHV有交叉性,3B4-B10无;利用免疫胶体金技术初步研制出CyHV-2免疫检测试纸条,试纸条能够检测到纯化的CyHV-2,后续将对免疫检测试纸条的灵敏度和特异性等进行进一步的优化。