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目的: 检测 Ad-hBMP-2在体外环境下对成骨细胞的生物学行为的影响,为Ad-hBMP-2和成骨细胞复合生物材料用于临床治疗骨缺损或整形用骨提供实验依据和理论指导。 方法: 1.应用人胚肾293细胞作为包装细胞,扩增携带hBMP-2表达片段的重组腺病毒载体Ad-hBMP-2,利用氯化铯密度梯度超速离心法对其进行纯化,应用50%感染量测定(infectious dose 50,ID50)方法对纯化的病毒液进行病毒滴度测定。 2.以新生(出生后1-3天)新西兰大白兔颅骨骨膜培养出的成骨细胞为细胞模型,通过倒置相差显微镜观察、四唑盐比色法(MTT法)检测、碱性磷酸酶(Alkali phosphate,ALP)活性测定、免疫细胞化学测定、RT-PCR检测和茜素红染色等方法观察Ad-hBMP-2转染后的成骨细胞和对照组成骨细胞的形态、生长、增殖、成骨功能的差异。以期对Ad-hBMP-2在骨组织工程临床的广泛应用提供实验依据。 结果: 1.本实验成功培养了293细胞,并扩增和纯化了Ad-hBMP-2,所得到的纯化的病毒滴度为1.58×1011pfu/ml。 2.免疫细胞化学染色:5天时Ad-hBMP-2转基因组hBMP-2单克隆抗体染色,胞浆呈现棕黄色异染,即阳性。对照组(未转染组)呈现阴性。 3.RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,逆转录—聚合酶链式反应)结果:Ad-hBMP-2转染组细胞RT-PCR结果阳性,对照组RT-PCR结果