目的 免疫排斥反应是角膜移植手术失败的主要原因，特别是高危病例，排斥率高达90％以上。研究如何预防和控制高危角膜移植术后的免疫排斥反应具有重要的意义。 T淋巴细胞介导的迟发性免疫排斥反应是角膜移植排斥反应的主要方式。最近大量的研究发现，基因重组合成的细胞毒T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4)可以高亲和力、特异地与APC细胞表面的B7结合，从而阻断CD28／B7这一共激活途径，使T淋巴细胞不能活化，进而阻止T淋巴细胞介导的免疫反应。目前在肾脏、心脏、皮肤等其它大器官移植中，人们已经发现利用CTLA4-Ig可以有效地延长移植器官的存活时间，甚至可以造成免疫耐受。 但是CTLA4-Ig应用于抑制器官移植免疫排斥反应仍存在许多问题。诸如CTLA4-Ig的半衰期短，只有50-70小时，临床应用时需反复用药；全身用药不方便，可能造成其它副作用等。因此，对CTLA4-Ig的局部应用，特别是通过转基因方法的应用是研究的重点。 目前CTLA4-Ig在角膜移植中的应用和研究很少，都没有完全阻止免疫排斥反应的发生。而且在转基因预防角膜移植免疫排斥反应的研究中，大部分研究是针对角膜内皮细胞的，理由是角膜内皮细胞是免疫排斥反应攻击的主要靶细胞。但同时又有大量研究表明，角膜基质和上皮细胞是主要的致敏原，因此，在用药途径上，不应该只针对角膜内皮细胞，而应该重视供受体的角膜基质和上皮。 本研究利用转基因技术，将cTLA4一19基因分别转染高危角膜移植动物模型兔供体眼角膜基质或内皮细胞中，或兔受体眼前房中，然后观察何种途径是抑制穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的主要途径，并对CTLA4一Ig局部转基因在抑制高危角膜移植免疫排斥反应中的作用作出评价。材料和方法 一、携带目的基因的病毒载体 所有用于本实验的重组腺病毒载体都是来自El区缺失的5型人腺病毒 (一)携带报告基因的病毒载体 1.Ad一LacZ:携带LacZ基因的腺病毒载体。由美国宾西法尼亚大学医学院基因治疗实验室陈有海教授惠赠。 2.Ad一GFP:携带编码绿荧光蛋白(green fluoreseenee protein，GFp)基因的腺病毒载体。由美国宾西法尼亚大学医学院基因治疗实验室梁凤歧教授惠赠。 (二)携带治疗基因的病毒载体 1.Ad一CTLA4一Ig(human):携带编码人细胞毒T淋巴细胞抗原4(cytotoxicTLymphocyteantigen，CTLA4)细胞外部分和人IgGFc的复制缺陷腺病毒，目的基因CTLA4一19由CMV启动子控制，分泌的CTLA4一Ig是可溶性的。由台湾长庚大学医学院，长庚纪念医院内分泌科Brend Ray一Sea Hsu教授惠增。 2.Ad一CTLA4一Ig(mice):携带编码鼠CTLA4和人IgGFc的腺病毒载体。由日本Yamaguchi University Sehool of Medieine，First Department of Surgery的李桃生讲师惠赠。 (三)病毒扩增和纯化 根据以往报道的方法，将携带各种基因的重组腺病毒转染293细胞，大量扩增后，反复冻融3次，经过两次CsCI梯度离心纯化。用快速空斑实验测定病毒滴度。 二、病毒转染效率的检测 (一)病毒转染293细胞的检测 1.Ad一GFP检测:转染293细胞出现典型CPE后，荧光显微镜下观察照才目。 2.Ad一cTLA4一lg检测: 1)Ad一CTLA4一Ig接种培养于24孔板的293细胞，内设1排空白孔。 2)按常规方法进行免疫组化检测，不同一抗分别用于不同培养孔。一抗包括羊抗人CTLA4(DAKO，SC一1628)，羊抗人xgG(SxGMA，I一 3352)，羊抗鼠CTLA4(Santa Cruz Bioteehnology，Ine.se一630，日本李桃生讲师惠赠)，Hamster Anti一Mouse CTLA4一FITC(Fluoreseein eonjungate)(SouthernBioteehnol。gy Assoeiates，Ine.1 790一02，李桃生讲师赠送)。 3)荧光标记二抗为(兔抗羊，FITC一eonjugated Rabbit Anti一Goat 19，DAKO，FO25O)。 4)碳酸甘油封片，荧光显微镜下(Olympus BX6o，日本)观察，照相。 三.、病毒转染兔角膜组织 新西兰大白兔(New Zealand White Rabbit，NZW)，体重2.skg一3.okg，雌雄不限。所有动物都是在山东省眼科学重点实验室动物饲养中心饲养，并符合ARvO有关用于研究目的动物的相关规定(ARVOResolution on the Use ofAnimals in Research)。 (二)角膜上皮转染 1.Ad一LacZ:取6只NZW兔，右眼角膜上皮划痕法接种100扒1l.4x一o8PFU/mlAd一Laez病毒液。取2只眼作为空白对照，接种Hank’S液。在接种后24h，48h，72h各处死2只兔，取角膜片，x一Gal检测法检测基因表达。 2，Ad一GFP:不划痕结膜囊滴入1 00 p 1 1 .4x10sPFu/m1Ad一GFP，关闭眼睑，按摩30秒。共接种6只兔的右眼，另外设2只空白对照眼，接种Hank’s液。在接种后24h，48h，72h各处死2只兔，取角膜片，荧光显微镜下观察有无荧光着色。空白对照眼进行同样观察。 (砚)结膜下转染 1.Ad一Lacz:取6只Nzw兔，分别在右眼结膜下注射loopl 1.4xl护PFU/ml Ad一LacZ和Ad一GFP。检测方法同上。 (四)角膜内皮转染:?