【摘 要】
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BMP/Smad信号通路参与调节卵泡颗粒细胞周期、细胞凋亡以及细胞类固醇的分泌过程。其中Smad9是重要的下游调节因子,调控目的基因的转录活动,本研究探索Smad9在牛卵泡颗粒细胞上的功能机制,为提高母畜繁殖力提供新的思路。通过免疫组化、qRT-PCR和Western blotting对Smad9在卵泡不同发育阶段颗粒细胞中进行定位与表达分析;通过RNA干扰技术沉默Smad9基因,检测周期、凋亡以
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31873002）； 山西省青年三晋学者专项； 山西省“1331 工程”重点学科建设专项；
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BMP/Smad信号通路参与调节卵泡颗粒细胞周期、细胞凋亡以及细胞类固醇的分泌过程。其中Smad9是重要的下游调节因子,调控目的基因的转录活动,本研究探索Smad9在牛卵泡颗粒细胞上的功能机制,为提高母畜繁殖力提供新的思路。通过免疫组化、qRT-PCR和Western blotting对Smad9在卵泡不同发育阶段颗粒细胞中进行定位与表达分析;通过RNA干扰技术沉默Smad9基因,检测周期、凋亡以及类固醇相关基因和部分蛋白的表达,通过Elisa测定细胞培养液中E2和P4的浓度。结果如下:（1）通过免疫组化试验检测Smad9在牛卵泡中的定位,结果表明,Smad9在牛卵泡颗粒细胞和膜细胞层均有表达;q RT-PCR结果表明:小卵泡和中卵泡颗粒细胞中Smad9 m RNA转录本相对丰度低于大卵泡颗粒细胞（P＜0.01）,而中卵泡颗粒细胞内Smad9 m RNA转录本相对丰度低于小卵泡（P＜0.05）;Western blotting结果显示中卵泡和小卵泡颗粒细胞中Smad9蛋白的表达量低于大卵泡（P＜0.01）,中卵泡颗粒细胞中Smad9蛋白表达量低于小卵泡（P＜0.05）。（2）通过RNA干扰技术将卵泡颗粒细胞中Smad9基因沉默后,MTT结果显示颗粒细胞增殖能力明显减弱;周期相关基因Cyclin D2、p21和PCNA m RNA转录本相对丰度极显著降低（P＜0.01）,Cyclin D1 m RNA转录本相对丰度显著降低（P＜0.05）,而p27和CDK4 m RNA转录本相对丰度有下降趋势但无差异（P＞0.05）;凋亡相关基因中Bcl-2m RNA转录本相对丰度无显著差异（P＞0.05）,而Bax和Caspase-3 m RNA转录本相对丰度显著升高（P＜0.05）,且Bcl-2与Bax的比值极显著降低（P＜0.01）,同时,Bax蛋白表达量显著上升（P＜0.05）,而Bcl-2蛋白没有显著变化（P＞0.05）;类固醇合成相关基因3β-HSD m RNA转录本相对丰度极显著降低（P＜0.01）,STAR和CYP19A1 m RNA转录本相对丰度显著降低（P＜0.05）,而CYP11A1 m RNA转录本相对丰度有下降趋势但无差异（P＞0.05）,同时类固醇合成相关的部分蛋白STAR表达显著降低（P＜0.05）,但CYP11A1和3β-HSD蛋白表达无差异（P＞0.05）;最后通过Elisa检测细胞培养液中雌二醇和孕酮的浓度,结果显示在沉默Smad9基因后E2和P4的浓度显著降低。本研究结果表明牛卵泡颗粒细胞层有Smad9表达,不同直径卵泡的颗粒细胞中Smad9的表达量不同,Smad9大卵泡中的表达量极显著高于小卵泡和中卵泡,且沉默Smad9基因可显著抑制细胞增殖。表明Smad9在牛卵泡生长发育过程中起重要调节作用。
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