论文部分内容阅读
肠道是营养物质消化吸收的主要场所,也具有重要的屏障作用。维持肠道稳态是健康养殖、提高动物生产性能的重要保障。肠道发育程度影响肠道的正常功能,遗传因素例如表观遗传机制的改变是引起肠道发育变化的重要因素之一。肠道微生物菌群的结构、外源饲料酶的添加也在肠道正常功能的维持中发挥着重要作用。本论文主要针对表观遗传修饰、肠道微生物菌群的结构、外源饲料酶的添加对肠道功能的影响进行了探究。表观遗传修饰与肠道代谢、免疫功能息息相关。组蛋白乙酰转移酶Mof可以特异性的乙酰化组蛋白H4（N端）的第16位赖氨酸位点（H4K16）,并参与调控动物机体的多种生理进程。然而,Mof对肠道功能的调节作用及对肠道微生物区系的影响却仍不清晰。本研究利用Mof肠道特异性敲除小鼠,探究其对小鼠肠道形态、功能及肠道微生物区系的影响,从而阐明表观遗传修饰基因mof对肠道发育及功能的调控机制。外源饲料酶的添加也是维持肠道正常功能的保障,这是通过破坏抗营养因子（例如纤维素等）,促进营养物质如蛋白质、淀粉和脂肪的消化利用,保证正常的肠道消化吸收功能。粗饲料中富含纤维素和木质素。因此,降解包裹在纤维素和半纤维素外面的木质素是提高粗饲料利用率、保障肠道健康的关键。漆酶是其中较为重要的一类木质素降解酶。然而直接将外源表达的重组漆酶直接应用于秸秆饲料化的研究尚未报道。因此,本文还研究了异源表达的农杆菌漆酶Atm的理化性质及其对玉米秸秆体外消化率的影响。取得的主要研究结果如下:1.组蛋白乙酰转移酶Mof对肠道功能的影响。利用Cre-loxP系统成功构建了mof基因肠道特异性敲除小鼠,qPCR和WB的结果均显示:敲除小鼠回肠、结肠组织中无Mof表达,且肠道上皮细胞中的H4K16乙酰化水平显著降低。随后,通过组织切片、免疫印迹、免疫组化及免疫荧光等方法研究mof的肠道特异性敲除对肠道形态、功能的影响。结果显示:与野生型小鼠相比,敲除小鼠的小肠长度显著减少（雌鼠:36.17±2.75vs 28.83±2.10;雄鼠:37.77±3.35 vs 31.67±1.76,P<0.05）、在回肠和结肠处的隐窝长度明显增加;敲除小鼠肠道中的潘氏细胞数量明显降低,且潘式细胞中溶菌酶的表达异常。为了进一步研究mof基因对小鼠肠道发育的影响,对小鼠肠道切片进行Ki67和Caspase-3免疫荧光染色分析,发现敲除小鼠肠道细胞的增殖与凋亡均升高。另外,还研究了mof敲除对紧密连接蛋白表达量的影响,结果显示:cldn5及cldn8的mRNA水平降低,小鼠肠道的屏障功能也遭到破坏。2.Mof肠道特异性敲除对肠道微生物区系的影响。对16s rDNA测序数据进行降噪处理后得到1540380条有效序列,并得到2506个OTU单元。利用Faith-pd方法和Shannon-Wiener方法进行α多样性分析,结果显示:盲肠样品的微生物菌群丰度最高,回肠样品的微生物菌群丰度最低,且两者差异显著。对样品进行Unweighted Unifrac主坐标轴分析发现,不同肠段的肠道微生物菌群差异显著。ANCOM分析结果显示,敲除与野生小鼠的肠道菌群存在菌属的丰度差异:普雷沃菌属和幽门螺旋菌属在敲除小鼠肠道中显著增加。3.漆酶相关基因的异源表达及其提高玉米秸秆消化率的应用。首先,以木腐样本为菌源,利用产漆酶培养基筛选出具有木质素降解能力及漆酶酶活的微生物（7株细菌及7株真菌）。选取一株具有较高漆酶酶活及较高木质素降解能力的细菌菌株为研究对象,利用热不对称交错PCR法扩增了其漆酶基因atm,并进行异源表达及纯化。利用生物化学方法检测了重组漆酶Atm的理化性质,结果显示:Atm是B型漆酶;以ABTS为酶活底物时,Atm的活性为85.4 U mg-1,其Km与Vmax值分别为230.8μM和32.8 s-1;最适温度为50℃,最适pH值为4.5;Cu2+能够提高Atm的活性;Atm对高温具有良好的耐受性、有较宽泛的pH耐受值,并对有机溶剂乙醇、甲醇、丙酮和DMSO等展现了较好的耐受性。为了研究Atm对玉米秸秆消化率的影响,将Atm预处理的玉米秸秆在瘤胃液中进行体外消化,结果表明:玉米秸秆的干物质消化率显著提高,分别由23.44%提高到27.96%（8 h）,29.53%提高到37.10%（24 h）;当Atm和纤维素降解复合酶联用时,不仅干物质消化率显著提高（P<0.05）,中性洗涤纤维消化率明显增加（从19.02%提高到24.55%,24h）,酸性洗涤纤维消化率也有明显增加（8 h:从5.81%提高到10.33%;24 h:从12.80%提高到19.07%;P<0.05）。综上所述,mof的肠道特异性敲除通过降低肠道中潘氏细胞的数量、影响溶菌酶的表达,紊乱肠道上皮细胞的增殖、凋亡能力,从而影响肠道的正常发育及功能,并且增加了普雷沃菌属和幽门螺旋菌属在肠道微生物区系中的丰度。由此,初步阐述了Mof对肠道发育及功能的调控机制。另外,农杆菌重组漆酶Atm对高温、pH以及有机溶剂具有良好的耐受性,与纤维素降解复合酶联用能够显著提高玉米秸秆的干物质消化率、中性洗涤纤维消化率和酸性洗涤纤维消化率,显示了重组漆酶Atm将木质素农副产品转化为动物饲料的潜在应用价值。此研究为进一步完善健康养殖、增加饲料利用率、提高动物生产性能提供理论基础及技术支持。