论文部分内容阅读
褪黑素在生物体中普遍存在。在动物中,褪黑素作为一种重要的神经激素调节昼夜节律。植物褪黑素最早于1995年被发现。二十余年来,国内外研究者在褪黑素参与植物生长发育和胁迫应答等方面开展了广泛研究,并且取得了很大的进展。然而,由于缺乏对其受体与信号转导途径的认识,植物褪黑素是否是一种新激素还存在很大争议。本研究以蚕豆和拟南芥为植物材料,利用药理学、生理学、细胞生物学、分子生物学以及遗传学等手段研究植物褪黑素的信号转导途径,鉴定了植物中首个可能的褪黑素受体（CAND2/PMTR1）,并揭示了褪黑素受体CAND2/PMTR1依赖的信号转导途径在气孔关闭和干旱胁迫中的调控机理。具体研究结果如下:1.使用不同浓度的褪黑素处理蚕豆叶片下表皮条考察褪黑素对气孔开度的调控机理。研究结果表明,5-20μmol/L褪黑素显著诱导蚕豆气孔关闭和保卫细胞H2O2产生。在10μmol/L褪黑素处理下,外源添加过氧化氢酶（CAT,H2O2清除剂）或二苯基氯化碘盐（DPI,NADPH氧化酶抑制剂）抑制了褪黑素诱导的气孔关闭和H2O2产生,而水杨羟污酸（SHAM,细胞壁过氧化物酶）则不起到抑制作用,表明褪黑素诱导的气孔关闭依赖NADPH氧化酶介导的H2O2产生。异源三聚体GTP结合蛋白（G蛋白）通过调控NADPH氧化酶活性和H2O2产生调节植物的气孔关闭,因此本研究随后考察了G蛋白是否参与褪黑素诱导的气孔关闭和H2O2产生。研究结果表明,褪黑素处理下外源添加Gα抑制剂GDP-βs降低了褪黑素诱导的气孔关闭和H2O2产生,而Gα激活剂GTP-γs即使在没有褪黑素的情况下也可以显著诱导气孔关闭和H2O2产生。由此可见,G蛋白α亚基是褪黑素信号传导途径中的关键组分,褪黑素通过G蛋白α亚基调节NADPH氧化酶介导的H2O2产生促进气孔关闭。2.以拟南芥突变体为材料,在分子遗传层面进一步揭示褪黑素诱导气孔关闭的信号转导途径并鉴定植物首个可能的褪黑素受体。与蚕豆类似,褪黑素能够诱导拟南芥H2O2产生和气孔关闭,而CAT和DPI能够抑制这个过程。与Col-0相比,NADPH氧化酶突变体rbohC和rbohD/F对褪黑素诱导的气孔关闭不敏感,表明NADPH氧化酶介导的H2O2产生作为褪黑素的下游信号诱导植物气孔关闭。进一步研究发现,G蛋白α亚基突变体gpα1-1和gpα1-2对褪黑素诱导的H2O2产生和Ca2+流入不敏感,说明褪黑素诱导的气孔关闭依赖G蛋白α亚基介导的H2O2和Ca2+信号通路。由G蛋白/G蛋白偶联受体介导的信号转导途径是真核细胞接受外界信号的保守机制。由于G蛋白参与褪黑素信号调控的气孔关闭,因此推测植物中的G蛋白偶联受体可能参与褪黑素信号的识别。本研究随后分析了拟南芥cand2、cand7和gcr1-1等G蛋白偶联受体突变体对褪黑素诱导的气孔关闭的敏感性,以筛选可能的褪黑素受体。研究结果显示,外源褪黑素诱导了Col-0、cand7和gcr1-1气孔关闭。但是,cand2对褪黑素诱导的气孔关闭不敏感,褪黑素诱导的Col-0中的气孔关闭、H2O2产生和Ca2+信号均在cand2突变体中被抑制。以上研究结果表明,CAND2参与褪黑素信号的识别,是一个可能的植物褪黑素受体。生物信息学和亚细胞定位分析结果表明,CAND2是一个可能具有七次跨膜α-螺旋结构的膜蛋白。双分子荧光互补实验结果表明CAND2能够与拟南芥中唯一的G蛋白α亚基（GPA1）特异性相互作用。GUS染色结果与荧光定量PCR显示,AtCand2在保卫细胞、子叶、芽、根等细胞和组织中广泛表达,且其表达程度受到的褪黑素水平的调节。以上研究结果表明,CAND2是一个可能的植物褪黑素受体,并被命名为植物褪黑素受体1（Phytomelatonin Receptor 1,PMTR1）。3.气孔是植物光合作用气孔交换的主要通道,也是蒸腾作用水分散失的主要途径。植物吸收的水分95%通过气孔扩散到大气中。因此,对气孔开度的调节是降低水分散失和提高水分利用效率的有效途径。为了进一步研究褪黑素受体依赖的信号途径在气孔开度和干旱胁迫中的作用机理,本研究构建了褪黑素受体PMTR1植物表达载体并获得了过表达的转基因拟南芥PMTR1-OX。研究结果表明,与Col-0相比,仅需0.1-1μmol/L褪黑素即可明显诱导PMTR1-OX气孔关闭和H2O2产生。且CAT或DPI均未能使PMTR1-OX中气孔开度恢复至对照组的水平。说明PMTR1-OX对褪黑素的敏感程度更高,且作用程度更强。干旱胁迫能够诱导植物内源褪黑素水平的上升,因此本研究随后考察了PMTR1在抗旱中的作用。在干旱处理14天后,PMTR1-OX的含水量约比Col-0高20%,干重是Col-0的1.2倍,而生物量的减少仅为Col-0的38%。表明与Col-0相比,PMTR1-OX表现出较强的抗旱能力。这些结果有助于理解干旱胁迫下褪黑素及其受体的调控机理,为褪黑素作为一种新的植物激素提供证据,并对其在农作物水分高效利用与抗旱胁迫等方面的应用提供理论基础。