在能源可持续发展进程中，新能源替代化石能源将是历史发展的必然。作为众多的可开发的新能源成员之一，生物质能是一种绿色生物将太阳能转化为化学能，进而贮存于生物体内的能量，包括木质纤维素、农业废弃物、水生植物、油料植物、有机植物加工废料、牲畜粪便等可用转化产能的有机物资源。而在生物质生产生物能源中，生物丁醇以其较高能量值、挥发度较低、容易运输、便于保藏、安全性高等优势，被认为是替代化石燃料的最佳选择之一，具有较大的发展潜力。
　　工业上将生物质能转化为生物丁醇主要方法是以生物质为底物，通过接入如梭状芽胞杆菌等丁醇发酵菌株进行发酵获得生物丁醇。为了追求更高的丁醇质量和产量，对其发酵条件的优化是重要的步骤之一，包括不同的碳源、发酵温度、酸碱环境等均会对菌株产生丁醇的效率有较大影响，而对梭菌本身的代谢途径进行改造如降低副产物的生成，从而获得一株无或少副产物产生、且能高效、低成本转化生物丁醇的菌株，也是利用微生物工业化生产生物丁醇的必经途径之一。另一方面，使用廉价而丰富的可再生原料成为了丁醇工业生产过程中值得关注的重要因素之一。与陆地上利用最广泛的木质纤维素相比，海洋类生物质如海藻多糖，因其具有较高的碳水化合物含量，已经成为了新一代具有高效转化为生物燃料潜力的生物质原料。通过体外水解体系的建立，或者将编码海藻多糖水解酶的基因导入梭菌，实现菌株能够高效利用琼胶多糖作为廉价碳源来转化生物丁醇的过程，不但可以降低生产成本、节约能源，而且还可以为未来其他生物质的利用提供了可行方案，在生物质能的发展中具有重要的意义。
　　基于上述研究背景和思路，本论文主要以丁醇产生菌株Clostridiumsp.WB为研究对象，通过分析梭菌WB的代谢通路，主要针对梭菌发酵过程中产生副产物如丙酮、丁酸的关键基因(乙酰乙酸脱羧酶adc、丁酸激酶buk)进行敲除、限制或减除，以降低其在发酵中对能量不必要的损耗。因此，本论文分别以乙酰乙酸脱羧酶丁酸激酶为靶目标，利用CRISPR/Cas9作为主要技术手段，以穿梭质粒pMTL80000系列作为载体，构建具有发挥向导作用的gRNA、具有双链切割效应的Cas9蛋白和作为同源模板进行同源修复的同源臂HAL和HAR等片段的功能质粒，实现目的基因的有效敲除。另一方面，为了实现海洋生物质转化生物丁醇的过程，本研究通过建立在梭菌中异源表达β-琼胶酶(Aga575)体系，初步实现其能以琼胶多糖转化生物丁醇的过程。
　　在本实验中已将构建完好的具有敲除功能的质粒p-CRISPR-adc成功导入梭菌中并且使用PCR等手段验证，获得了疑似敲除成功的杂合子，有望获得adc基因缺失的重组体，实现敲除平台的建立，以此作为试验菌株进行发酵评估。另外靶向另一基因buk的质粒p-CRISPR-buk也已构建完成，通过质粒转化后便可得到buk缺失的重组体。最后为实现梭菌对琼胶多糖的利用，质粒p-eglA-Aga575构建完成并成功导入梭菌体内，该重组体可将琼胶酶表达并分泌至胞外，直接利用琼脂糖作为碳源，最终成功建立在梭菌中异源表达β-琼胶酶体系，实现梭菌对廉价碳源的利用，降低生物丁醇生产成本。