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细胞自噬是一种溶酶体依赖性降解途径,可应对多种类型的应激反应以维持细胞稳态。研究指出自噬在基因组稳定性的维持中发挥关键作用。微核(micronuclei,MN),又称为细胞质染色质片段,作为基因组不稳定性的重要指标,能够直观敏感地反映遗传物质的损伤程度。有研究发现自噬能够直接靶向微核结构将其清除,但仅有2-5%的比例。除了对受损的细胞器、蛋白及染色质片段的直接清除作用外,自噬还可以通过影响DNA损伤应答、氧化还原稳态的调节以及细胞分裂等一系列重要的细胞进程进而影响基因组的稳定性,然而这些过程对介导自噬维持基因组稳定性的贡献程度并不明确。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是氧正常代谢的自然副产品,在细胞信号传递和稳态维持方面至关重要。但过量的ROS会造成氧化压力,对蛋白质、DNA等重要细胞组分产生毒性作用。氧化压力是造成DNA损伤的一大重要原因,进一步诱导微核形成。细胞中过量的ROS也是诱导自噬激活的重要因素之一,而关于自噬对于氧化还原稳态调节的报道并不一致。那么,自噬作为保护细胞对抗逆境的重要过程能否降低微核频率呢?同时对于氧化还原稳态的调节作用又是如何?而这种调节作用是否会介导自噬对微核频率的影响呢?基于以上背景及疑问,我们设计并开展了系列工作得到如下结果:1.遗传毒剂诱导微核发生采用细胞免疫荧光方法分析细胞微核频率,发现羟基脲(Hydroxyurea,HU)以及X-Ray处理均能够有效诱导微核发生。细胞免疫荧光共染LaminB 1和γ-H2AX以检测微核核膜完整性和γ-H2AX的关系,结果显示γ-H2AX阳性微核的核膜相比于阴性微核趋向于不完整。2.自噬激活能够降低肿瘤细胞中的微核及ROS采用Western Blotting实验观察自噬激活剂Rapamycin及Torin1在两种肿瘤细胞HT1080及U2OS中的自噬激活效率,LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例上调表明自噬被激活。细胞免疫荧光检测自噬激活后细胞的微核频率,结果显示自噬能够降低肿瘤细胞自发形成的微核。自噬激活剂联合HU检测微核频率发现自噬能够降低复制压力诱导产生的微核。另外Rapamycin也能够降低X-Ray诱导的微核。以上结果表明自噬激活能够降低肿瘤细胞中自发形成及遗传毒剂诱导产生的微核。流式细胞仪分析细胞活性氧水平,发现自噬激活能够有效降低两种肿瘤细胞本底水平及遗传毒剂诱导产生的ROS。3.自噬降低衰老细胞中升高的微核和ROS选择不同传代次数的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs),通过β-X-gal染色方法观察两代细胞的衰老比例,结果显示P18的衰老比例要明显高于P10。Western Blotting方法对两代细胞的自噬效率进行评估,发现衰老细胞LC3-Ⅱ呈现严重累积,表明衰老细胞自噬能力障碍。采用细胞免疫荧光方法检测微核频率,发现衰老细胞的微核频率要明显高于年轻细胞且能够被自噬激活剂Rapamycin所降低。通过流式细胞术分析细胞ROS水平,发现与微核频率结果相对应,衰老细胞中的ROS水平要明显高于年轻细胞且同样能被Rapamycin所降低。4.抑制自噬导致微核频率升高Western Blotting方法评估自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)自噬抑制效率,发现LC3-Ⅱ呈现严重累积,自噬底物p62也呈现上调趋势表明自噬受到抑制。通过ATG5 siRNA敲低ATG5发现自噬起始过程受阻。细胞免疫荧光评估微核频率发现自噬抑制剂及ATG5 siRNA均能够升高肿瘤细胞及MSCs的微核频率。5.抗氧化剂能够拯救自噬抑制引起的微核升高采用流式细胞术检测细胞ROS水平,结果显示在MSCs中自噬抑制剂及ATG5 siRNA均能够升高细胞活性氧水平。而在两种肿瘤细胞中并未观察到明显变化,可能的原因主要是由于相比于正常细胞,肿瘤细胞的本底ROS水平较高。以上结果提示,在MSCs中氧化压力可能介导了自噬抑制导致的微核升高。采用Western Blotting实验评估细胞中γ-H2AX的蛋白表达情况,结果显示抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)能够降低由于自噬抑制所引起的γ-H2 AX的积累。细胞免疫荧光实验分析微核频率,发现NAC也能够降低自噬抑制导致的微核频率的升高。以上结果说明在MSCs中氧化还原调节介导了自噬对微核频率的影响。6.自噬抑制CHK1激活Western Blotting实验观察细胞中p-CHK1的蛋白水平,结果显示自噬激活能够降低三种细胞中复制压力诱导产生的p-CHK1的的上调。而自噬抑制后,细胞中活化型CHK1呈现明显上调。此结果表明自噬抑制CHK1激活,且与文献中自噬缺陷导致的基因组不稳定性是由于CHK1下调引起同源重组修复功能受损的解释不一致,提示我们本实验体系中自噬并不是通过升高CHK1活性水平来维持基因组稳定性。总之,本文探究了自噬对微核频率的影响,明确自噬对氧化还原稳态的调节作用,提出了氧化还原调节在一定条件下介导自噬对微核频率的影响,为自噬对基因组稳定性维持的关键作用提出新的解释。