桃小食心虫嗅觉受体基因or48的克隆、表达和组织定位研究

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桃小食心虫(Carposina sasakii Matsumura)是严重影响我国苹果、山楂、枣等果树产业发展的重要果实害虫。由于发生世代周期长、发生不整齐、幼虫在果内蛀食等特点,传统的化学防治策略施药周期长、防效不易把控,而且还会造成环境污染、抗药性增强以及食品安全等系列问题。调控桃小食心虫的嗅觉行为可以达到防控的目的,并具有安全、高效和环境友好的优点。嗅觉受体OR(odorant receptor)在昆虫的嗅觉感受系统中具有枢纽性的作用。本研究克隆了桃小食心虫嗅觉受体or48的基因,应用qPCR技术研究了or48基因在桃小食心虫不同发育时期不同性别成虫触角中的表达特性,应用免疫组织化学技术对OR48进行组织定位,为进一步研究桃小食心虫的嗅觉识别机制奠定了基础,给桃小食心虫趋避剂和引诱剂的开发和应用提供了科学依据。主要研究结果如下:1.桃小食心虫or48基因的克隆及表达谱分析设计了or48基因的特异性引物,并经逆转录PCR技术克隆得到了or48基因的c DNA,生物信息学分析表明:or48基因的c DNA序列总共长1359 bp,编码452个氨基酸和1个终止密码子,有7个跨膜结构域,相对分子质量为52.1 kDa。呈疏水性,没有信号肽,具有嗅觉受体一般的结构特征。OR48与棉铃虫的OR85e的相似性最高,氨基酸序列相似性为61.69%。系统发育树结果表明在亲缘关系上桃小食心虫OR48与斜纹夜蛾OR12、褐头卷叶蛾OR71、斜纹卷蛾OR71、绿头卷叶蛾OR71和浅绿头卷叶蛾OR71较为接近。以β-actin为内参基因,运用qPCR技术对成虫触角中or48基因进行相对表达量分析。结果表明,桃小食心虫or48不同性别、不同发育时期表达量差异明显。相对表达量从高到低依次为:羽化24h未交尾(M)>羽化24h未交尾(F)>刚羽化(F)>交尾后(M)>刚羽化(F)>交尾后(M)。推测桃小食心虫or48基因可能参与了寻找寄主植物、配偶以及产卵点等重要生命过程。2.桃小食心虫OR48在成虫触角中的组织定位对桃小食心虫OR48的氨基酸序列进行分析,选择C-SNWPSMGGKTRRML进行肽段合成,并作为抗原制备多克隆抗体。运用免疫组化技术对桃小食心虫羽化24h未交尾的雌雄成虫的触角进行OR48组织定位。结果显示:在桃小食心虫的触角中有毛形、刺形和锥形等多种嗅觉感器类型。而OR48蛋白主要在毛形感器的基部进行表达,说明毛形感器有识别配体化合物的功能。综上所述,本研究通过逆转录PCR技术克隆得到了桃小食心虫or48基因的c DNA全长,并对嗅觉受体OR48的结构、氨基酸序列以及系统发育进行了生物信息分析,发现桃小食心虫OR48具有嗅觉受体蛋白典型的结构特征。通过qPCR技术研究了or48在不同性别不同发育时期的差异表达,它在雌雄成虫的触角中都有不同程度的表达,且羽化后24h未交尾时期的雄成虫的表达量为最高,推测or48参与了寻找寄主和交配产卵等生命过程。应用免疫组化技术完成了嗅觉受体OR48在触角中的定位,发现OR48在毛形感器的基部有部分表达,说明毛形感器具有识别配体化合物的功能。从结构、表达和定位三个方面系统并全面的研究了桃小食心虫or48的基因特性,为桃小食心虫嗅觉信号转导系统的深入探索开辟了研究体系,为桃小食心虫行为调节技术的研发提供了科学依据。
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