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鸭坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）的5′与3′端非编码区（5′UTR与3′UTR）与非结构蛋白5（NS5）在病毒复制周期中发挥重要作用。NS5为鸭TMUV最大且最保守的病毒蛋白,具有RNA依赖的RNA聚合酶（Rd Rp）和甲基转移酶（MTase）活性,是重要的抗病毒药物靶点。5′UTR和3′UTR形成特征性保守RNA结构,对病毒复制复合体（VRC）形成以及病毒基因组复制调控至关重要。为了阐明NS5与5′UTR及3′UTR在病毒复制中的作用,本论文基于鸭TMUV反向遗传学系统,利用突变技术主要开展以下研究内容:1、鸭TMUV NS5的生物特性与关键功能位点及其对病毒复制的调控;2、5′UTR与3′UTR的RNA二级结构及其环化对病毒复制的调控;3、NS5反式回补缺陷型病毒基因组及其与非编码区的协同调控作用。分别简述如下:1.鸭TMUV NS5的生物特性与关键功能位点及其对病毒复制的调控鸭TMUV NS5蛋白主要定位于内质网中,基于双荧光素酶报告试验表明,过表达鸭TMUV NS5通过RIG-I而非MDA5途径激活鸭干扰素（IFNβ）启动子活性,突变NS5酶活性中心（GDD）与引物环（Priming loop,PL）降低了IFNβ启动子的激活效应,表明NS5的免疫激活作用依赖于Rd Rp酶活性功能。PL区点突变使病毒RNA复制能力丧失或者降低,并且发现复制能力与NS5的Rd Rp酶活性具有正相关关系,其中S791D位点突变导致复制能力显著下降,病毒增殖能力与组织中病毒载量显著高于野生型重组病毒（r TMUV-WT）。利用Nano Bi T活细胞实时蛋白相互作用技术（Nano Bi T-PPI）研究MTase-Rd Rp在NS5分子内的互作特征,发现GTR连接区及保守互作界面位点介导MTase-Rd Rp互作。缺失鸭TMUV NS5的GTR连接区(ΔGTR268-275)或分别替换为乙型脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）以及寨卡病毒（ZIKV）的同源GTR连接区(Sub-JEVGTR、Sub-WNVGTR、Sub-ZIKVGTR),仅Sub-JEVGTR保持复制能力。特别地F467A突变体未降低MTase-Rd Rp间的互作,而显著性降低RNA复制、病毒增殖能力及鸭胚致死率,表明F467在病毒复制、增殖与毒力上发挥重要作用。此外研究发现在鸭TMUV NS5的N390与Q392氨基酸残基处引入精基酸（N390R、Q392R）后NS5获得进入细胞核的能力,并显著性减弱鸭TMUV的复制与增殖能力。通过免疫共沉淀（Co-IP）、Nano Bi T-PPI与间接免疫荧光试验（IFA）证实病毒感染或过表达NS5入核后减弱与NS3的互作能力。另外,NS5核定位改造的突变重组病毒(r TMUV-NS5NLSmut)诱导大量IFNβ转录,而NS5入核后不影响Rd Rp酶活性,表明病毒刺激的过量IFNβ转录与Rd Rp酶活性功能刺激RIG-I通路无关。2.5′UTR与3′UTR的RNA二级结构及其环化对病毒复制的调控基于鸭TMUV 5′UTR与3′UTR二级结构的预测,对5′UTR与3′UTR特异性碱基与关键二级结构进行突变,利用反向遗传学系统研究突变体的复制特性。发现:5′UTR的Mut TLCT/TC、Mut TLAG/GA、Mut U7thC、Mut SSD和Δpoly Us突变体复制能力减弱;改造3′TL区（ΔTL-3′UTR和rt TL-3′UTR）,替换3′SL的S2与S3茎区Lg TLJEV,以及缺失突变Δ3′UTR299-436nt均丧失复制能力;Mut A79U、ΔDB1-3nt、ΔDB2-2nt、Mut AG45thGA以及替换3′SL S3茎区的Sm TLJEV均削弱RNA复制。并通过碱基错配与恢复碱基配对的方式,探索5′UTR-3′UTR环化对病毒复制的调控作用。发现5′UTR-3′UTR的互作未受任一环化基元中碱基错配而破坏,并且除Mut 5′UAR-2nt与Mut 5′DARII-5nt突变体以外,碱基错配均导致环化基元突变体丧失复制能力,而cy DARI-4nt与cy CS-5nt突变体通过恢复碱基配对而部分恢复复制能力。此外,碱基错配的重组病毒增殖能力较弱,而恢复碱基配对的突变病毒增殖能力普遍增强。综上,鸭TMUV 5′UTR与3′UTR通过特异性核苷酸序列与二级结构共同调控病毒复制特性。3.NS5反式回补缺陷型病毒基因组及其与非编码区的协同调控作用在U2OS与BHK-21细胞中创建黄病毒反式回补系统,发现鸭TMUV的野生型复制酶（Replicase-WT）与NS5 Rd Rp酶缺陷型复制酶（Replicase-AAA）均能刺激模板的报告基因活性,且复制酶具有交叉利用黄病毒模板的功能,表明复制酶对模板的激活作用不依赖于NS5的Rd Rp活性,且NS5反式参与由5′UTR-3′UTR介导的翻译过程。随后研究了5′UTR、3′UTR与NS5嵌合突变体的复制特性,发现NS5与5′UTR特异性识别从而调控病毒增殖与复制。用体外转录的RNA验证了5′UTR-3′UTR与NS5蛋白互作,并证明互作位点对复制至关重要。综上,鸭TMUV NS5与非编码区协同调控病毒的生命周期。通过研究NS5 Rd Rp酶活性的免疫激活效应、MTase-Rd Rp互作特性、以及NS5核定位定向改造后减弱鸭TMUV复制与增殖的分子机制,从NS5生物特性的角度解析关键位点对病毒复制特性的影响。同时,探索了非编码区顺式作用元件的RNA碱基与结构对复制的作用。并基于黄病毒反式回补系统与影响非编码区与NS5互作的一系列突变体,揭示了NS5与非编码区协同调控病毒复制的特性。研究结果为揭示鸭TMUV的基因组复制机制提供了理论基础,同时为抗病毒药物提供了新的靶点。