1.研究背景动脉粥样斑块钙化（atherosclerotic calcification,AC）是在动脉粥样硬化负荷斑块内发生的钙化,是一种最常见的钙化性血管病变,在炎症因子和氧化脂质等病理性刺激作用下,斑块内血管细胞亚群发生成骨样分化而形成的。动脉粥样斑块钙化与斑块的不稳定性密切相关,是心血管疾病的独立危险因素。糖尿病微环境中存在着普遍的促钙化刺激,如炎症、氧化应激损伤、高糖和无机磷酸盐等,可促使血管平滑肌细胞等向成骨样细胞转分化。虽然已有体外研究证实高糖可以促进血管细胞成骨分化,但糖尿病加速动脉粥样斑块钙化的分子机制仍然知之甚少,而且也缺乏相应的体内研究。Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）又称 Cbfal,在细胞成骨分化中起着核心作用。Runx2通过与成骨细胞特异性顺式作用元件2结合,调控骨钙蛋白和碱性磷酸酶的表达,进而调控细胞成骨分化。Runx2的表达在正常血管中较低,但在人和小鼠的动脉粥样斑块钙化病灶中明显升高。此外,研究表明,糖尿病导致Runx2活性升高并加速主动脉的僵硬度。相反,针对Runx2的靶向干预可有利于减轻动脉粥样斑块钙化的发生发展。PARP-1（Poly ADP-ribose polymerase 1）是多聚 ADP 核糖聚合酶（PARP）家族中最丰富的一种亚型,可参与DNA修复、基因转录和细胞死亡等病理生理过程,在多种糖尿病并发症中伴有重要角色。新近研究表明PARP-1可以调节骨吸收和破骨细胞活性,而且抑制PARP可以阻遏骨肉瘤细胞和小鼠间充质干细胞的成骨分化。然而,PARP-1与Runx2表达之间的关系仍不明确,糖尿病能否通过激活PARP-1加速动脉粥样斑块钙化也尚不清楚。为探索上述问题,我们繁殖了 ApoE-/-PARP-1-/-双基因敲除小鼠,建立糖尿病动物模型并给予高脂喂养,观察PARP-1基因敲除对糖尿病动脉粥样斑块钙化的影响,并探讨潜在的作用机制。2.研究目的（1）观察糖尿病对高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉钙化的影响;（2）观察PARP-1基因敲除能否减轻糖尿病动脉粥样斑块钙化;（3）通过基因芯片分析等,探索敲除PARP-1基因改善糖尿病动脉粥样斑块钙化的作用机制。3.研究方法（1）动物模型的建立将PARP-1-/-小鼠与ApoE-/-小鼠杂交,获得实验用的ApoE-/-PARP-1-/-双基因敲除小鼠及同窝的ApoE-/-小鼠,将其分为高脂组和糖尿病高脂组。连续5天腹腔注射STZ（50 mg/kg）制备糖尿病模型。连续高脂喂养12周后可发生自发性动脉粥样斑块钙化。（2）脉搏波传输速度（PWV）使用超声心动图仪测量PWV。连续吸入1～2%异氟烷麻醉小鼠,通过多普勒精确坐标测量从主动脉弓到腹主动脉的曲线距离（D2-D1;以mm为单位）,同时用心电图信号记录测量时间延迟（T2-T1;以ms为单位）。通过公式（D2-D1/T2-T1）计算 PWV,以 m/sec 表示。（3）茜素红染色小鼠主动脉根部置于4%多聚甲醛固定48小时,然后OCT包埋,于冰冻切片机连续切片（5μm）。取冰冻切片,室温晾干4小时以上,水化15分钟,然后置于茜素红染液中,室温避光孵育15分钟,PBS冲洗三遍×5分钟,透明剂脱水后封片,显微镜下观察茜素红染色阳性区域,并拍照分析。（4）主动脉钙含量的测定将小鼠主动脉于70℃下孵育30分钟,以使其脱水留取干重,并用0.6mM HCl在37℃下脱钙48小时。使用钙含量测定试剂盒（Sigma）测量主动脉中钙浓度,并通过主动脉的干重进行标准化。（5）血脂、血钙、血磷的测定心尖取血后,留取各组小鼠血清,于山东大学齐鲁医院检验科用生化分析仪检测血脂、血钙、血磷。（6）免疫组织化学染色取冰冻切片,室温晾干4小时以上,水化15分钟,然后置于抗原修复液中,进行微波加热修复。5%山羊血清封闭30分钟后,滴加经PBS稀释好的一抗（PARP-1及Runx2）,然后于4℃过夜。37℃复温30分钟,后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗再置于37℃孵育1小时,显微镜下进行DAB显色。（7）基因芯片分析取小鼠主动脉组织,提取RNA,应用Affymetrix小鼠基因组430 2.0芯片进行转录组基因芯片分析。热图、IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件分析均由上海吉凯基因有限公司协助完成。（8）凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）用Pierce核蛋白抽提试剂盒提取小鼠主动脉组织核蛋白,将生物素标记的Stat1探针加入到不同组的核蛋白中,加入上样缓冲液调匀,加样跑胶。转膜至尼龙膜,然后紫外灯交联15分钟,用试剂盒中的封闭液、洗脱液进行处理,滴加发光液曝光。4.研究结果（1）敲除PARP-1对ApoE-/-小鼠的血糖、血脂、血钙、血磷均无显著影响我们发现在诱导糖尿病12周后,糖尿病ApoE-/-小鼠血糖、血浆总胆固醇和甘油三酯水平较高,而PARP-1的敲除对小鼠体重、血糖、总胆固醇及甘油三酯水平都没有明显影响。糖尿病及PARP-1缺失对血清钙、血磷均无显著影响。（2）敲除PARP-1能够降低糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉根部的钙化面积我们发现,高脂喂养12周足以诱导糖尿病ApoE-/-小鼠的主动脉根部出现明显的动脉粥样斑块钙化。与单纯高脂喂养组相比,糖尿病高脂喂养组动脉粥样斑块区域的钙化面积比例显著增加。而敲除PARP-1基因的糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉根部钙化面积比例显著降低。（3）敲除PARP-1能够降低糖尿病ApoE-/-小鼠的主动脉钙含量,并减轻血管僵硬度我们发现糖尿病高脂喂养组小鼠主动脉的钙含量显著高于单纯高脂喂养组。超声心动图测定小鼠主动脉PWV,结果也显示糖尿病高脂喂养组小鼠PWV显著高于单纯高脂喂养组。这些数据表明糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉钙含量增加,主动脉僵硬度增加,提示糖尿病大大加速了 ApoE-/-小鼠的血管钙化进程。而与糖尿病ApoE-/-小鼠相比,敲除PARP-1基因显著降低了糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉钙含量及血管僵硬度。（4）敲除PARP-1能够降低糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉Runx2表达免疫组化研究结果显示,与单纯高脂喂养组相比,糖尿病高脂喂养组ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块区域的PARP-1及Runx2 阳性面积显著增加。而敲除PARP-1基因的糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉根部Runx2阳性面积明显降低。进一步的RT-PCR研究结果显示,与单纯高脂喂养组相比,糖尿病高脂喂养组ApoE-/-小鼠主动脉Runx2的mRNA水平显著增加,而敲除PARP-1基因可以显著抑制Runx2的mRNA水平。（5）敲除PARP-1通过调控成骨分化相关转录因子来减轻糖尿病动脉粥样斑块钙化我们进行基因组芯片分析,寻找敲除PARP-1可能影响的差异表达的基因。结果发现与糖尿病ApoE-/-小鼠相比较,敲除PARP-1的糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉组织中许多与成骨分化相关的基因差异性表达。在这些基因中,TRAIL和ESRRG（编码ERRy）与动脉粥样斑块钙化相关。此外,ATF3、TBX3和ELOVL6等基因与细胞成骨分化密切相关。而更有意思的是,我们的结果发现敲除PARP-1可以调控多个转录因子的表达,包括Stat1、ATF3、EGR1、EGR2、EGR3、ID4、NR4A1 和 TBX3。我们进一步用 IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件分析这些转录因子与下游成骨分化基因的相互作用网络,结果显示这些转录因子与成骨分化基因关联密切,可能是敲除PARP-1减轻糖尿病动脉粥样斑块钙化的潜在机制。（6）敲除PARP-1可以抑制Stat1的转录活性凝胶迁移实验（EMSA）结果发现,糖尿病上调主动脉组织Stat1的转录活性,而敲除PARP-1的主动脉组织中Stat1的转录活性被明显抑制。既往文献报道转录因子Stat1可以负向调控成骨细胞中Runx2的表达。而敲除PARP-1在抑制Stat1转录活性的同时也抑制了 Runx2的表达,提示血管组织中Stat1调控Runx2的机理可能与成骨细胞有所区别。5.结论（1）糖尿病可以上调高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉Stat1/Runx2活性,增加主动脉根部斑块的钙化面积、主动脉钙含量及主动脉僵硬度。（2）敲除PARP-1可以降低糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块的钙化面积,降低主动脉钙含量及主动脉僵硬度。（3）敲除PARP-1可以抑制Stat1/Runx2活性,可能是减轻糖尿病动脉粥样斑块钙化的主要分子机制。1.研究背景血管钙化是指钙盐矿物质在动脉壁细胞外基质中的病理性沉积,与心血管发病率和死亡率密切相关。血管钙化主要分为中膜钙化及内膜钙化,其中内膜钙化通常与动脉粥样硬化伴随发生,又称为动脉粥样斑块钙化（atherosclerotic calcification）。但无论是血管内膜I丐化还是中膜钓化,血管平滑肌细胞（vascular smoothmusclecells,VSMCs）向成骨样细胞转化都是其主要原因。VSMCs向成骨样细胞转化时,碱性憐酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性增加,表达骨形态发生蛋白-2（Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）及骨妈蛋白（osteocalcin,OCA）;同时VSMCs释放基质小泡（matrix vesicle,MV）,成为钙盐及磷酸盐聚集的场所,最终导致钙化的发生。正常血管组织中的VSMCs处于收缩表型状态,表达a-SMA、SM-22CI,calponin及smoothelin等一系列收缩型蛋白,以维持动脉壁的结构及功能。{[I VSMCs并小是终末分化细胞,可在高糖、高憐、氧化低密度脂蛋白、糖基化终末产物等刺激下,由收缩表型向合成表型转化,其收缩性能下降,而分泌、迁移性能增强,成骨相关蛋白ALP、OPN表达增加,最终成为具有分泌功能的成骨样细胞。糖尿病微环境中高葡萄糖、炎症、氧化应激和无机磷酸盐等刺激因素,均可促使血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化,加速血管钙化。尽管有休外研宂显?高浓度的葡萄糖可以促进血管平滑肌细胞成骨分化,但其确切的分子机制仍未完全明确,也缺乏相应的干预措施。在细胞成骨分化过程中,Rum相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）起着核心作用。Runx2可通过与成骨细胞特异性顺式作用兀件2结合,调控OCA和ALP的表达,进而调控细胞成骨分化。运用基因敲除等措施抑制平滑肌细胞RunX2的表达也被证实能够减轻VSMCs的成骨分化及钙化。新近有研宂报道,PARP抑制剂能够抑制骨髓间充质干细胞和骨肉瘤细胞Runx2、Bmp2等的表达,从而有效地抑制其成骨分化。但PARP-1与Runx2的内在关系仍不清楚,抑制PARP-1能否减轻VSMCs的成骨分化也亟待明确。我们在论文I研究中也己证实,糖尿病上调主动脉组织Statl的转录活性及Rimx2的表达,可能是糖尿病加速动脉粥样斑块钙化的重要分子机制。而敲除PARP-1可以抑制Statl的转录活性及Runx2的表达。那么高糖能否通过Statl/Runx2轴加速VSMCs的成骨分化及钙化?在VSMCs中敲除PARP-1能否通过抑制Statl/Runx2而减轻高糖诱导的成骨分化及妈化?基于上述问题,我们在本研究中提取原代平滑肌细胞,并用高糖骨化培养基培养,观察PARP-1基因敲除对VSMCs成骨分化及钙化的影响,同时探讨高糖是否通过PARP-1/StatI轴加速VSMCs成骨分化及钙化。2.研究目的（1）观察高糖对VSMCs成骨分化及钙化的影响;（2）探讨敲除PARP-1能否通过抑制Statl/Runx2而减轻高糖诱导的VSMCs成骨分化及钙化;（3）探讨Statl调控Runx2表达及成骨分化的分子机制。3.研究方法（1）小鼠原代平滑肌细胞提取、培养及鉴定繁殖敲基因小鼠,同时留取同窝野生型对照小鼠。将6周龄小鼠脱颈处死,在体视显微镜下剥离小鼠主动脉、剪碎至长度约1mm的小块,加少量培养基、轻轻涂于培养瓶内,组织贴块法提取原代平滑肌细胞,待培养3天后即可见从血管组织块中爬出梭形细胞。将提取的平滑肌细胞种于细胞爬片上,免疫荧光a-SMA染色以鉴定提取的平滑肌细胞。（2）建立细胞钙化模型骨化培养基的配置:DMEM培养基中加入10%胎牛血清及10mM p-磷酸甘油。取上述3-5代细胞种于6孔板,分别用含5.5mM葡萄糖的骨化培养基（NG）或27.5 mM葡萄糖的骨化培养基（HG）培养,每三天更换培养基,连续三周。（3）细胞茜素红染色、Von Kossa染色及钙含量测定待细胞培养至预定时间,弃去培养基,PBS清洗后用4%多聚甲醛固定。茜素红染色时,往培养板中滴:to茜素红染液,室温避光孵育15分钟,PBS清洗,甩干培养板,相机拍照。Von Kossa染色时,往培养板中滴加5%硝酸银溶液,置于紫外灯下曝晒15min,然后加入5%亚硫酸钠溶液,PBS清洗,甩干培养板,相机拍照。检测细胞钙含量时,用细胞刮刀将培养板中的各组细胞分别刮下,各孔加入等量裂解液裂解细胞,测定各组的蛋白浓度,按照Sigma钙含量检测试剂盒（比色法）进行后续操作,并将钙离子浓度经过蛋白浓度进行校正,结果用(ag/mg蛋白表示。（4）实时定量RT-PCRTrizo1法提取各组细胞RNA,进行逆转录及RT-PCR反应,测定Runx2、Osteocalcin及ALP的mRNA表达。（5）蛋白印迹Western Blot收取细胞,RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白,Western Blot检测各组PARP-1、Statl、Runx2、a-SMA、OPN、Vimentin表达。（6）细胞转染将细胞均匀种板,待细胞密度生长至40%左右时,进行转染。Statl腺病毒转染时,估算细胞数目,然后根据细胞数目及MO1值计算病毒用量。转染siRNA时,取两个无菌EP管分别加入25(HiLOpti MEM+5pL Lipo3000、25（VL Opti MEM+100pmo1的siRNA,混匀后室温静置15min,将其加入培养孔,6h后更换新的培养基。（7）双荧光素酶报告实验（Luciferase Activity Assay）用Lipo3000及P3000将构建的野生型及突变型报告质粒分別与海肾质粒pRL-TK共转染至293T细胞,同时pGL3-Basic质粒作为阴性对照,48h后收集细胞,用Promega试剂盒检测荧光素酶活性。（8）染色质免疫沉淀实验（Chromatin Immunoprecipitation Assay,ChlP）将细胞用4%多聚甲醛固定,收集细胞,超声破碎细胞。设置Input组,Statl抗体组,IgG抗体组,孵育抗体过夜,后加入珠子,洗涤沉淀M介物,65°C解交联过夜。回收DNA片段,进行PCR扩增,将产物进行琼脂糖凝胶电泳,分析结果。4.研究结果（1）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的VSMCs钙化我们发现VSMCs经骨化培养基培养3周后出现明显的钙化,尤其是高糖刺激下的VSMCs。而PARP-1的敲除抑制了高糖诱导的VSMCs钙化。同时,高糖骨化培养基中的VSMCs钙含量显著增加,而敲除PARP-1能抑制钙含量的增加。（2）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的VSMCs成骨分化关键基因的表达我们发现,高糖刺激下的VSMCs成骨分化关键基因Runx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白的mRNA水平均显著增高,而PARP-1的敲除抑制了高糖诱导的这些基因的表达。蛋白免疫印迹结果显示,高糖刺激能够显著上调Statl/Runx2的蛋白表达,而敲除PARP-1能够抑制Statl/Runx2的表达。这与我们论文I研究内容一致。（3）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的VSMCs由收缩表型向合成表型的转化蛋白印迹实验结果显示,高糖刺激能够抑制收缩型蛋白a-SMA的表达,而促进合成型相关蛋白OPN、Vimentin的表达,表明高糖刺激下VSMCs向具有分泌功能的成骨样细胞转化。而敲除PARP-]的VSMCs即使在高糖刺激下,其收缩型蛋白a-SMA的表达并未显著降低,而合成型蛋白OPN、Vimentin也未显著升高。（4）敲除Statl能够抑制高糖诱导的VSMCs钙化我们利用Statl-flox小鼠与平滑肌细胞-Cre工具鼠Acta2-Cre小鼠交配,得到平滑肌细胞敲除Statl的小鼠,然后原代培养其平滑肌细胞,并给予高糖骨化培养基刺激。3周后发现野生型VSMCs出现显著的钙化,而敲除Statl的VSMCs钙化不明显。同时,敲除Statl的VSMCs钙含量显著降低。（5）敲除Statl能够抑制高糖诱导的VSMCs成骨分化关键基因的表达敲除Statl显著抑制了高糖诱导的成骨分化关键基因Rimx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白的mRNA水平。蛋白印迹结果也证实,敲除Statl能够显著抑制Runx2的蛋白表达。而敲除Statl并未显著影响PARP-1的蛋白表达,表明Statl处于PARP-1的下游,而PARP-]可以通过Statl抑制Runx2的表达。这一结果也证实了我们论文I研究中对血管组织Statl/RmiX2轴的推测,Statl能够正向调控Runx2的表达,与成骨细胞的负向调控有所不同。（6）敲除Statl能够抑制高糖诱导的VSMCs由收缩表型向合成表型的转化在高糖骨化培养基刺激下,与野生型VSMCs相比,敲除Stall的VSMCs其收缩型蛋白a-SMA较高,而合成型蛋白OPN、Vimentin明显降低。（7）过表达Statl能够上调Runx2的表达,并加重VSMCs钙化过表达Statl能够显著上调Runx2的表达,经高糖骨化培养基培养两周后,茜素红和Von Kossa染色均显示,过表达Statl明显加重野生型VSMCs的弼化,同时细胞钙含量也明显上升。（8）Statl能够直接结合在Runx2启动子的核心区域,转录调控其表达我们发现,Statl siRNA处理能明显抑制野生型Runx2荧光素酶报告质粒活性。而突变5’-TCTCCAGTAAT-3’这一预测位点后Runx2启动子活性明显下降,表明该位点是Runx2启动子活性的核心区域;但Statl siRNA对该突变型质粒的荧光素酶活性无显著影响,表明Statl很有可能是通过该结合位点来转录调节Runx2表达。用覆盖Runx2启动子区域5’-TCTCCAGTAAT-3’的特异性引物进行r ChIP实验,结果证实Statl特异性结合Runx2启动子的5’-TCTCCAGTAAT-3’区域。5.结论（1）高糖刺激能够促进VSMCs成骨分化,并加速其钙化,而敲除PARP-1能够逆转这一过程。（2）敲除PARP-1能够通过抑制Statl/Runx2来减轻高糖诱导的VSMCs钙化。（3）敲除PARP-1可以通过Statl抑制高糖诱导的VSMCs|1|收缩表型向合成表型转化。（4）Statl能够直接结合在Runx2启动子的核心K域,转录调控其表达。1.研究背景动脉粥样硬化病变进展到一定程度时,可在负荷斑块内发生钙化,称为动脉粥样斑块钙化（atherosclerotic calcification）,是心血管发病率和死亡率的重要独立危险因子。尤其在合并糖尿病的患者人群中,斑块钙化的风险大大增加。斑块钙化是斑块内血管细胞亚群在病理性刺激作用下,发生成骨样分化而形成的。但动脉粥样斑块钙化的细胞来源尚不清楚,巨噬细胞在动脉粥样斑块钙化中的作用仍存在争议。既往研究往往使用体外共培养的方法,发现巨噬细胞可以通过释放促炎细胞因子来增强血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化。虽然动脉粥样斑块钙化的细胞大部分来源于VSMCs,但遗传谱系示踪技术发现斑块钙化区域,仍有接近20%的Runx2阳性细胞来自骨髓单核细胞。新近研究表明,除VSMCs以外,巨噬细胞同样可以释放基质小泡（matrix vesicles,MVs）,成为钙盐及磷酸盐聚集的场所,最终导致钙化的发生。这些研究均表明巨噬细胞可能直接参与动脉粥样斑块钙化的发生。而巨噬细胞的表型转化也可能影响着动脉粥样斑块钙化的进展。有研究报道,促成骨分化的巨噬细胞基因表达谱与M1型巨噬细胞呈显著正相关,但与M2型成负相关。巨噬细胞在高糖刺激下,CDllc、iNOS和TNF-α的表达上调,而精氨酸酶1的表达下调,促使巨噬细胞向M1表型转换。但高糖能否促使巨噬细胞向成骨样细胞分化还未见报道。Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）,在细胞成骨分化中起着核心作用。在VSMCs中抑制Runx2的表达,也被证实能够减轻成骨分化及钙化。但尚不清楚高糖能否通过上调Runx2加重巨噬细胞成骨分化及钙化。新近有研究报道PARP-1可以结合在抗酒石酸酸性磷酸酶的启动子上,调节骨吸收和破骨细胞活性,而且阻断PARP可以抑制小鼠间充质干细胞和骨肉瘤细胞的成骨分化。我们在论文Ⅱ研究中也已证实,在VSMCs中敲除PARP-1能通过抑制Stat1/Runx2减轻高糖引起的成骨分化和钙化。但仍不清楚在巨噬细胞中是否也存在类似的机制。为回答上述问题,我们在本研究中利用原代巨噬细胞及RAW264.7巨噬细胞,用骨化培养基培养,分别给予正常或者高浓度的葡萄糖刺激,观察PARP-1敲除或抑制对巨噬细胞成骨分化的影响,同时探讨高糖是否通过PARP-1/Stat1轴加速巨噬细胞成骨分化。22.研究目的（1）观察骨化培养基中的巨噬细胞能否发生成骨分化及钙化;（2）观察高糖对巨噬细胞成骨分化及钙化的影响;（3）探讨敲除PARP-1能否通过抑制Stat1/Runx2而减轻高糖诱导的巨噬细胞成骨分化;（4）探讨PARP-1能否通过Stat1调控巨噬细胞的极化。3.研究方法1）小鼠腹腔巨噬细胞提取、培养及鉴定繁殖敲基因小鼠,同时留取同窝野生型对照。取8周龄小鼠,腹腔注射3%淀粉液,72h后脱颈处死小鼠,超净工作台中,消毒小鼠腹部皮肤,暴露腹部肌层。用眼科镊轻提腹部肌层,剪开一处小口,用无菌吸管吸取DMEM培养基注入腹腔,轻揉后吸取悬液至离心管中,如此反复三次,1000rpm离心5min后用10%的DMEM重悬,种至培养板。将提取的巨噬细胞用APC标记的抗小鼠F4/80流式抗体进行标记,流式细胞仪检测其阳性率。（2）细胞钙化模型的建立配置骨化培养基:DMEM培养基中加入10%胎牛血清及10mMβ-磷酸甘油。取上述细胞种于6孔板,分别用含5.5mM葡萄糖的骨化培养基（NG）或27.5 mM葡萄糖的骨化培养基（HG）培养,每三天更换培养基,连续培养三周。（3）细胞茜素红染色及钙含量测定（4）实时定量RT-PCR Trizol法提取各组细胞RNA,进行逆转录及RT-PCR反应,测定Runx2、Osteocalcin及ALP的mRNA表达。（5）蛋白印迹收取细胞,RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白,Western Blot检测各组PARP-1、Stat1、p-Stat1、Runx2、Arg1、iNOS表达。（6）巨噬细胞吞噬Dil-ox-LDL用Dil标记的ox-LDL孵育巨噬细胞,4h后用PBS清洗,4%多聚甲醛固定细胞,染核后用激光共聚焦显微镜观察。（7）流式细胞术待巨噬细胞培养至特定时间后,将巨噬细胞用刮刀刮下,用PE标记的CD11c及APC标记的CD206抗体共同孵育。然后使用FACS Calibur流式细胞仪上机检测,并使用Flow Jo软件分析数据。4.研究结果（1）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞钙化我们发现骨化培养基培养的巨噬细胞出现明显的钙化,而高糖骨化培养基中的巨噬细胞钙化更明显,敲除PARP-1抑制了高糖诱导的巨噬细胞钙化。同时,与正常糖浓度的骨化培养基相比,高糖骨化培养基培养的巨噬细胞钙含量显著增加,而敲除PARP-1能抑制钙含量的增加。在RAW264.7巨噬细胞中也发现类似的现象。（2）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞成骨分化关键基因的表达高糖刺激下巨噬细胞Runx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白的mRNA水平均显著增高,而PARP-1的敲除抑制了高糖诱导的这些成骨分化关键基因的表达。同时免疫印迹结果也显示,敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的Runx2表达。在RAW264.7巨噬细胞中也发现,PARP-1抑制剂PJ34能够抑制高糖诱导的Runx2表达。（3）敲除PARP-1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞极化野生型小鼠的巨噬细胞在高糖刺激下CD11c和iNOS表达升高,而抗炎表型标志物CD206和精氨酸酶1表达明显降低,表明高糖刺激能够促使巨噬细胞由M2型向M1型转化;但敲除PARP-1能够抑制这一转化。同时高糖可以上调磷酸化Stat1及总Stat1表达,但敲除PARP-1后这一活性被抑制。在RAW264.7巨噬细胞中也发现,骨化培养基培养的巨噬细胞CD206表达降低,表明成骨分化时M2型巨噬细胞减少,而高糖刺激能够促进这一转化,应用PARP-1抑制剂PJ34则能逆转这一过程。（4）敲除PARP-1能够抑制巨噬细胞的脂质吞噬与野生型巨噬细胞相比,敲除PARP-1的巨噬细胞吞噬ox-LDL的作用明显减弱。（5）PARP-1敲除的巨噬细胞条件培养基并不加重VSMCs钙化野生型巨噬细胞培养基处理的VSMCs出现明显的钙化,但PARP-1敲除的巨噬细胞培养基处理的VSMCs其Runx2表达较低且未出现显著钙化。（6）敲除Stat-1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞钙化Stat1敲除的巨噬细胞经高糖骨化培养基培养,并未出现明显的钙化。同时,敲除Stat1的巨噬细胞钙含量显著降低。表明Stat1的敲除能够抑制高糖诱导的巨噬细胞钙化,而敲除PARP-1能通过Stat1/Runx2轴抑制巨噬细胞的钙化。（7）敲除Stat1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞成骨分化关键基因的表达敲除Stat1显著抑制了高糖诱导的Runx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白的mRNA水平。进一步的蛋白免疫印迹结果也显示,敲除Stat1能够显著抑制巨噬细胞中Runx2蛋白的表达。表明在巨噬细胞中,敲除PARP-1能通过Stat1抑制高糖诱导的成骨分化关键基因的表达。（8）敲除Stat1能够抑制高糖诱导的巨噬细胞极化敲除Stat1能够抑制CD11c和iNOS表达,而促进CD206和精氨酸酶1表达。表明敲除Stat1能够抑制高糖诱导的M1型极化,而敲除PARP-1可通过Stat1通路来调控巨噬细胞的极化。5.结论（1）高糖刺激能够促进巨噬细胞成骨分化,并加速其钙化,而敲除PARP-1能够逆转这一过程。（2）敲除PARP-1能够通过抑制Stat1/Runx2来减轻高糖诱导的巨噬细胞钙化。（3）敲除PARP-1可以通过Stat1抑制高糖诱导的巨噬细胞向M1型极化。