NECL1(nectin-like molecule 1),又名CADM3/IGSF4B/TSLL1/SynCAM3,是由本实验室于1998年首次克隆报道的一个基因,它是神经系统特异表达的免疫球蛋白样的细胞粘附分子。NECL1是一个膜蛋白,由398个氨基酸组成,含有由3个Ig结构域组成的胞外区、单一跨膜区及短的胞内区。在本实验室的前期工作中,我们发现NECL1的胞内区可将蛋白4.1N募集到细胞膜,并解析了NECL1胞外区第一个V domain的三级结构,发现NECL1胞外区第72位的苯丙氨酸对其形成二聚体很重要。目前的研究报道提示,NECL1通过同源或异源性相互作用在突触形成、轴突束及髓鞘轴突形成、小脑形态发生中发挥重要的作用。2001年国外其它实验室发现在RNA水平上,NECL1在神经胶质瘤细胞系中的表达明显下降或缺失,可能是神经胶质瘤的一个潜在抑癌基因。本论文重点对NECL1在神经胶质瘤中表达下降或缺失的表观遗传机制进行了研究。采用Real-time PCR及免疫组织化学方法发现,NECL1在6种人神经胶质瘤细胞系及18例人神经胶质瘤组织(8例Ⅱ级,5例Ⅲ级,5例Ⅳ级)中的表达明显下降或缺失,这在RNA水平及蛋白水平上均提示NECL1很可能是神经胶质瘤的一个抑癌基因。一般情况下,DNA高甲基化与组蛋白去乙酰化常与基因的表达缺失有关,而DNA去甲基化与组蛋白乙酰化常与基因的表达激活有关。根据上述提示,本论文从表观遗传调控方面研究了NECL1在神经胶质瘤中表达缺失的机制。应用5’RACE技术确定了NECL1的转录起始位点(命名为+1位)后,我们将NECL1启动子区系列缺失片段重组到报告基因载体中,在293ET、T98G及U251细胞系中进行双荧光素酶报告基因实验,确定了NECL1转录所必需的基本启动子区。生物信息学分析表明,NECL1启动子区存在CpG岛。亚硫酸氢盐修饰后测序(bisulfitesequencing)发现,在神经胶质瘤细胞系及神经胶质瘤组织中,NECL1启动子未发生高甲基化。上述结果说明,NECL1在神经胶质瘤中的表达缺失不是由NECL1启动子区的直接甲基化引起。确定NECL1的表达下调与DNA甲基化无关后,我们随后检测了神经胶质瘤组织中组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)的活性,发现在神经胶质瘤组织中,HDAC的活性较正常组织高,并且用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理神经胶质瘤细胞系后,NECL1的表达得到恢复,这些结果说明,NECL1的表达缺失与组蛋白去乙酰化有关。染色质免疫沉淀实验发现,TSA处理神经胶质瘤细胞系T98G和U251后,NECL1启动子区的组蛋白发生了乙酰化。文献报道,TSA能通过Sp1结合位点激活某些基因的表达。生物信息学分析表明,NECL1基本启动子区存在两个潜在的Sp1结合位点。荧光素酶报告基因实验表明,TSA处理细胞后NECL1的转录活性明显升高,并且只有转录起始位点上游的Sp1结合位点对TSA的刺激产生反应。DNA亲和层析结果表明,Sp1可以特异性结合于NECL1的基本启动子区。将该Sp1结合位点突变后进行双荧光素酶报告基因实验发现,TSA处理细胞后NECL1的转录活性没有升高。这些实验结果表明,TSA能通过Sp1结合位点激活NECL1的表达。根据相关文献提示,TSA处理细胞前,Sp1可能与HDAC等共抑制复合物结合而抑制基因的表达,而TSA处理细胞后,Sp1便募集p300/CBP等共激活复合物而促进基因的表达。因此,实验中运用ChIP及Co-IP方法检测了TSA处理前后Sp1与HDAC1及p300/CBP等的结合情况。结果表明,TSA处理神经胶质瘤细胞前,Sp1能与HDAC1结合,与p300/CBP不结合;而TSA处理神经胶质瘤细胞后,Sp1与HDAC1的结合明显减弱,与p300/CBP的结合增强。依据本部分的研究结果,我们构建了TSA激活NECL1表达的表观遗传调控模型,有效解释了TSA激活NECL1表达的分子机制。此外,我们还通过生物信息学分析、N-糖苷酶F(N-Glycosidase F)处理实验、定点突变、细胞粘附等方法首次证明了NECL1是一个具有单一N糖基化位点的糖蛋白,并表明其糖基化位点能影响细胞-细胞之间的相互作用。