背景宫颈癌是全球女性的第三位常见恶性肿瘤。放射治疗作为其主要的治疗手段，在临床治疗中取得了良好效果，但仍然存在失败的案例，其主要原因为肿瘤盆腔内复发。目前，放疗后复发癌治疗普遍困难，平均5年生存率不超过20%。放疗敏感性降低是放疗后复发肿瘤的普遍特点。因此，探索宫颈癌复发后放疗抗拒机制，提高放疗敏感性对复发癌的治疗具有重要意义。近年来放射生物学研究认为：肿瘤细胞在放疗后会产生放射抗拒的异质细胞，这群细胞是产生抗拒性的主要原因。目前，国内外已有多种恶性肿瘤成功建立获得性放射抗拒细胞株的报道，但建株方式多样尚无公认的标准。因此，探索宫颈癌放射抗拒细胞株的建立模式十分必要。此外，建立的宫颈癌放射抗拒细胞株可为后续研究提供可靠的模型。DNA双链是放射线打击的主要靶点，DNA损伤修复能力是影响肿瘤放射敏感性的重要因素。在证实了Hela-R细胞株的DNA损伤修复增强后，我们试图利用DNA损伤修复相关基因的表达，解释其DNA修复能力提升的原因和机制。基因的表达调控具有多种模式，其中转录调控与转录后调控最为重要。基因芯片技术是研究基因转录调控的重要方法，利用基因芯片可以观察到多数已知基因的转录情况。绘制宫颈癌放射抗拒细胞株的基因转录差异谱，对研究宫颈癌放射抗拒机制可能具有重要指导意义。微小RNA(microRNA，miRNA)作为一类广泛存在于真核生物中的非编码单链小分子RNA，是重要的转录后调控因子。多项研究已证实了miRNA在肿瘤的发生发展的重要作用，但其在肿瘤放射抗拒中的作用仍未阐明。因此，利用miRNA芯片绘制宫颈癌放射抗拒细胞株的miRNA表达差异谱，再结合基因芯片结果，将会为宫颈癌放疗增敏提供新的理论依据与作用靶点。目的1、建立宫颈癌放射抗拒细胞株(Hela-R)，为研究宫颈癌放射抗拒机制提供细胞模型2、明确参与Hela-R细胞株放射抗拒的DNA损伤修复基因3、绘制Hela-R细胞株的基因转录差异谱与miRNA表达差异谱4、探索miRNA调控Hela-R细胞株放射抗拒的作用机制材料与方法1、采用常规剂量分割法与亚致死剂量法分别建立宫颈癌获得放射抗拒细胞株。采用克隆形成实验分析不同亚组细胞的放射抗拒性。采用CCK-8法测细胞增殖能力，采用流式细胞仪测定细胞凋亡与细胞周期。2、采用彗星实验与Edu掺入实验测定细胞DNA损伤修复能力。采用Westren-blot检测DNA损伤应答相关基因(ATM与GADD45α)的表达情况。3、采用Affymetrix公司Genome U219Array Plate绘制宫颈癌放射抗拒细胞株基因转录差异谱，采用Agilent公司miRNA芯片绘制miRNA表达差异谱。采用Targetscan与microRNA.org网站预测miRNA的靶基因。采用qRT-PCR实验验证基因芯片与miRNA芯片结果。利用Western-blot检测miRNA-181a mimic转染后BAG4的表达情况。免疫组化检测BAG4在宫颈癌组织中的表达。结果1、采取常规分割法建立的亚细胞株的放射抗拒性均优于亚致死剂量组，其中2Gy25次组具有最强的放射抗拒性(平均致死剂量D0=4.81Gy)，我们将其命名为Hela-R细胞株。Hela-R细胞株受到6MV6Gy X射线照射后24h，增殖速度快于亲本细胞(Hela)，早、晚期凋亡率均低于Hela细胞株。但在照射48h与72h后其增殖速度减慢，且细胞周期出现了显著的G2期阻滞。2、彗星实验中采用相同剂量的X线处理Hela与Hela-R细胞株，1h后两者彗星尾长无差异。照射后12h、24h、48h，Hela-R细胞株的彗星尾长显著短于Hela细胞株。5-乙基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验中亦用相同X线处理以上两种细胞。处理后1h，Hela-R细胞株的胞核内掺入了更多的DNA修复原料类似物EdU。以上结果均表明Hela-R细胞株的DNA修复能力明显强于Hela细胞株。3、给予相同放射线处理后，Hela-R细胞株的ATM磷酸化水平高于其亲本细胞，说明其DNA损伤应答的强度与速度均优于亲本细胞。相同放射线处理前、后，Hela-R细胞株中G2期阻滞相关蛋白GADD45α的表达随时间逐步上升，且同期均高于Hela细胞株。这提示GADD45α是致使Hela-R细胞株G2期阻滞的重要原因。4、基因芯片与miRNA芯片结果提示：Hela-R与Hela细胞株之间存在9个差异表达的DNA损伤修复相关基因，其中7个miRNA表达增高，2个表达降低；9个抗凋亡基因表达增高。Hela-R与Hela细胞株存在49个差异表达的miRNA，其中10个miRNA表达增高，39个表达降低。经过生物信息学分析预测，qRT-PCR及Western-blot验证发现在Hela-R细胞株中miRNA-181a的表达缺失通过、削弱了其对抗凋亡基因BAG4的表达调控作用，高表达上调的BAG4促使Hela-R细胞株产生放射抗拒性。5、BAG4蛋白在宫颈癌组织中表达显著高于正常宫颈组织。23例放疗后残存宫颈癌组织中均可见BAG4蛋白的表达。结论1、采用常规分割法单次2Gy照射25次模式可建立稳定的宫颈癌放射抗拒细胞株(Hela-R)。2、Hela-R细胞株较亲本细胞具有更突出的放射抗拒性、DNA损伤修复能力及放射后G2期阻滞与抗凋亡能力。3、X线照射后ATM磷酸化水平增高与GADD45α表达上调是Hela-R细胞株DNA损伤修复能力增强与G2期阻滞的主要原因。4、miRNA-181a对BAG4调控的缺失是Hela-R细胞株放射抗拒的重要始动因素之一。