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内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。