调控卵巢卵泡发育是提高动物繁殖效率的主要途径之一。哺乳动物卵泡发育过程中,99.9%以上的卵泡会发生闭锁退化并消失,早期的一些报道指出,卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞(Granulosa cell,GCs)凋亡密切相关,但GCs凋亡调控机制仍不完全清楚。本课题组前期采用FSH超排处理成年母羊,获得不同直径卵泡液和GCs,基于RNA-seq高通量测序和iTRAQ定量蛋白组学联合分析发现,随着卵泡直径的增加,卵泡液和GCs中POSTN表达量逐渐升高。因此提出假设:卵泡发育过程中,FSH与POSTN可能存在一定的相关性,但其具体调节机制尚不清楚。本论文以绵羊卵泡及GCs为研究对象,系统地探究POSTN在卵泡发育过程中表达规律及FSH-POSTN存在的表达调控机制,主要试验结果如下:1.绵羊POSTN基因cDNA的克隆及表达分析。绵羊中克隆出1557 bp长的POSTN cDNA序列,可编码由518个氨基酸组成的蛋白,克隆的绵羊POSTN与牦牛和奶牛同源性较近。POSTN基因在绵羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、子宫和卵巢组织中均有表达,其中卵巢组织中表达量较高,而且随着卵泡直径增加,POSTN表达量逐渐升高,且在卵泡中的GCs中呈高表达。免疫荧光染色发现POSTN在GCs的细胞核和细胞质中都有分布。试验进一步利用RAI法检测不同直径卵泡液和GCs中激素与POSTN含量变化,结果显示,POSTN在不同直径卵泡液和GCs中的变化与FSH存在显著正相关性,表明POSTN可能参与调节卵泡发育进程,而这一过程可能受FSH影响。2.FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用。采用10 ng/mL FSH对体外培养GCs处理24 h,能显著增加GCs中POSTN表达,并加速细胞增殖进程,减少其凋亡,还有效促进GCs增殖相关基因PCNA、Ccnd-2和抗凋亡相关基因Bcl-2表达。另外,敲减GCs中POSTN基因,能显著降低FSH条件下引起的POSTN表达上调,并抑制GCs增殖、分化过程,增加其凋亡,同时下调GCs增殖分化基因PCNA、Ccnd-2与抗凋亡基因Bcl-2的转录,上调凋亡相关基因Bim、FasL和Caspase-3的表达。3.FSH通过PI3K-AKT-FOXO1信号通路调控POSTN表达。检测FSH涉及的多条信号通路,发现绵羊卵泡GCs中FSH主要通过激活PI3K、AKT和FOXO1信号通路影响POSTN表达,进而抑制GCs凋亡。进一步分析PI3K、AKT和FOXO1三者关系,结果显示FSH处理能同时激活这三种激酶活性;阻断PI3K或AKT后,FSH对FOXO1激活作用被阻断;而阻断FOXO1后,PI3K和AKT活性不受影响。PI3K抑制剂能同时阻断FSH对AKT和FOXO1的诱导,而AKT抑制剂能阻断FOXO1活性但不能阻断PI3K活性。另外还发现阻断AKT后,POSTN的表达量显著降低,即使加入10 ng/mL FSH在24 h内也无法恢复上调POSTN的转录,未能完全挽救GCs凋亡过程。4.FSH通过调节转录因子SRF调控POSTN表达。分析POSTN转录调控区,发现POSTN上游-1至-387 bp区域内包含1个SRF和1个JunD结合位点,进一步对结合位点定点突变分析,发现位于-222至-210的SRF结合位点突变明显降低了POSTN转录活性;同时还发现10 ng/mL FSH处理GCs 24 h后,能促进SRF表达,实现POSTN转录增强,该结果与ChIP分析结果相一致。因此推测,适量FSH一定时间内可能通过调节转录因子SRF调控POSTN表达,表明SRF可能是FSH调节POSTN表达以促进GCs生长的核心因子。综上所述,本论文主要围绕POSTN在绵羊卵泡GCs凋亡及卵泡闭锁中的作用及其分子调控机制进行了研究,建立了 FSH、POSTN,GCs凋亡和卵泡存活之间的联系,发现了 FSH-PI3K-AKT-FOXO1信号轴与GCs中POSTN表达的调控机制。本论文结果有助于进一步阐明卵泡存活/闭锁的分子机制,也为提高家畜繁殖效率提供新的理论基础。