蛋白质的可逆磷酸化在原核和真核生物中发挥着重要的调节功能。细菌的蛋白质磷酸化修饰主要由组氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶催化,其中对双组分调控系统的组氨酸激酶研究较多。近年来,细菌中的真核样丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）及磷酸酶（STP）受到关注,然而多数细菌有多个STK,由于功能冗余,解析每个STK的调控功能比较困难。我们发现,链球菌属的多数成员只有一套STK/STP,是研究细菌丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶调控作用及机制的优秀材料。目前已有多项有关STK和STP调控作用的研究,发现STK和STP对猪链球菌的生长、代谢和致病性发挥着重要的调控作用,有的调控效应相反,也有的调控效应一致,其调控机制尚不清楚。STK/STP作为一套磷酸化/去磷酸化系统,具有平行或交叉的信号调节网络,调节着许多不同的生理和致病过程,不能孤立地进行研究。本论文首先比较研究了STK和STP对猪链球菌生长、细胞分裂和毒力的调控作用,然后通过蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析了STK/STP对猪链球菌蛋白质表达谱和蛋白质磷酸化的调控,部分解释了STK/STP调控猪链球菌生长、细胞分裂和致病性的分子机制。本研究还揭示了STK在猪链球菌和肺炎链球菌中的不同定位模式及STK的PASTA结构域在其中的重要作用,构建了STK与细胞分裂相关蛋白的互作网络,为深入探究STK调控链球菌细胞分裂的分子机制奠定了基础。1.STK和STP对猪链球菌生长和毒力的调控作用本研究以猪链球菌2型SC-19菌株为研究材料,分别构建了stk和stp基因的单基因缺失菌株（Δstk、Δstp）和双基因缺失菌株（ΔstpΔstk）,系统比较了STK或/和STP缺失对猪链球菌生长、形态和致病性的影响。在营养丰富的TSB培养基中,Δstp和ΔstpΔstk的生长曲线与SC-19类似,而Δstk到达平台期的OD600低于SC-19。在合成培养基CDM中,Δstk几乎不能生长,Δstp的生长未受影响,ΔstpΔstk的生长速率下降,却比Δstk快。在CDM培养基中额外添加复合营养物（胰蛋白胨或蛋白胨）及多种维生素时显著恢复了Δstk的生长缺陷。以上结果表明,在富营养的条件下,Δstk的生长未受影响;在最小营养条件下,Δstk的生长严重受损,且维生素可以显著恢复Δstk的生长缺陷。此外,?stp、?stk和?stp?stk均形成长链。可见,STK和STP都可以调控猪链球菌的形态、生长和代谢,STK比STP发挥的调控作用更显著。深入的细胞形态学观察发现,与SC-19相比,Δstp形成趋于圆形的细胞以及Z环与细胞长轴夹角异常的细胞,而Δstk形成多个Z环且收缩异常的细胞,?stp?stk的细胞形态相对正常。细胞的长宽比统计发现,Δstp、Δstk和?stp?stk的长宽比均显著降低。为了进一步理解STK和STP对猪链球菌细胞分裂的调控作用,本文测定了Δstp和Δstk的磷酸酶活性,结果发现?stp的总磷酸酶活性确实显著下降,而?stk却无显著变化,暗示STK和STP在猪链球菌细胞分裂中都发挥着重要的调控作用。为了比较STK和STP对猪链球菌致病性的调控作用,本文用一系列体外和体内致病性试验比较了SC-19、Δstk、Δstp和ΔstpΔstk的致病性特征。生物被膜形成试验发现,Δstk和ΔstpΔstk的生物被膜形成能力显著增强,而Δstp无显著变化。小鼠巨噬细胞吞噬试验发现,Δstp、Δstk和ΔstpΔstk的抗吞噬能力均下降。小鼠致病性试验发现,与SC-19相比,Δstk和ΔstpΔstk感染小鼠的死亡率显著降低,而Δstp却无显著变化。小鼠组织器官定植试验发现,Δstp、Δstk和ΔstpΔstk的定植能力均显著下降。竞争性定植试验发现,Δstk的定植能力弱于Δstp,而ΔstpΔstk介于两者之间。因此,在致病性调控方面STK比STP发挥着更加重要的作用。2.STK和STP调控猪链球菌蛋白表达和全局磷酸化本研究比较分析了Δstk、Δstp和SC-19菌株的蛋白质表达谱和磷酸化蛋白质谱,部分解释了STK/STP调控猪链球菌生长、细胞分裂和致病性的分子机制。TMT蛋白质组学分析发现,在Δstk中有139个差异表达蛋白,其中37个上调,102个下调;在Δstp的82个差异表达蛋白中,47个上调,35个下调。说明stk缺失对猪链球菌全局蛋白表达的影响更大,这与其对表型的影响更显著是一致的。STK主要影响无机离子代谢、转录和核苷酸代谢类蛋白的表达,STP主要影响氨基酸代谢、无机离子代谢和能量代谢类蛋白的表达。代谢相关蛋白差异表达分析发现,辅酶A结合蛋白和吡哆胺激酶的表达量在?stk中显著下调,而在?stp中却无明显差异,暗示STK在猪链球菌维生素代谢中发挥着重要的调控作用。毒力相关因子（VFs）差异表达分析发现,?stk中VFs下调的数目比?stp中多,其中Ssn A、DPS和Ide S的表达量在?stk中显著下调,而在?stp中却无明显差异。因此,在生长代谢和致病性的调控方面STK比STP发挥着更加重要的作用。用丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体分别富集Δstk、Δstp和SC-19菌株的磷酸化蛋白质并进行质谱分析,与SC-19菌株相比,在?stk中有67个差异磷酸化蛋白（39个上调,29个下调）,在?stp的50个差异磷酸化蛋白中有14个上调和38个下调。在Δstk中磷酸化水平降低的蛋白质有三分之一与细胞分裂相关,包括Map Z、Gps B、Fts Z、Div IVA、Sep F、Fts W、Mlt G、Jag和Glm S,其中Map Z、Gps B、Fts Z、Div IVA和Jag已经被证实是STK的磷酸化底物,其它蛋白质主要与代谢和蛋白质翻译相关。在Δstp中磷酸化水平升高的蛋白质中有4个与细胞分裂相关,包括Div IVA、STK、Mlt G和Glm M,其它蛋白质则主要与代谢相关。STK和STP在猪链球菌细胞分裂调控中的重要作用,蛋白质磷酸化修饰调控猪链球菌细胞分裂的机制值得深入研究。3.STK调控链球菌细胞分裂的分子机制前人及本研究均提示,STK作为一种跨膜蛋白,是链球菌细胞分裂复合物的组成部分,其本身是否直接（不只是通过磷酸化修饰）参与链球菌细胞分裂过程尚不清楚。本研究首先比较了STK蛋白在猪链球菌和肺炎链球菌细胞分裂过程中的亚细胞定位模式,构建了STK与细胞分裂相关蛋白的互作网络,为深入探究STK调控链球菌细胞分裂的分子机制奠定了基础。蛋白质的亚细胞定位发现,猪链球菌的STK蛋白(STKSS)在细胞分裂早期定位于细胞中央,并随着细胞分裂位点的移动而移动,而肺炎链球菌的STK蛋白(STKSP)在其细胞分裂过程中始终定位在细胞中央,不随分裂位点移动而移动。将STKSP的表达质粒转化到猪链球菌中,发现STKSP在猪链球菌中的定位模式与STKSS一致,可能是因为STKSP与STKSS在猪链球菌中形成异源二聚体。生物信息学分析发现,STKSS与STKSP的激酶结构域的氨基酸序列高度相似,但它们的胞外PASTA结构域相似性较低。将STKSS的PASTA结构域替换成STKSP的PASTA结构域,形成杂交体STKSS(PASTASP),结果发现杂交体在猪链球菌中的定位与STKSP在肺炎链球菌的定位类似。因此,PASTA结构域是决定STK在链球菌细胞分裂过程中定位模式的关键因素。细菌双杂交试验发现,STK与细胞分裂相关蛋白质具有较广泛的互作关系,包括Mru A1、Mru C、Mru Z、Mru D、Mru G、Mra Y、Mlt G、Fts W、Fts E、Fts X、Fts Q、Fts L、Fts B、Mre C、Mre D、PBP2x、PBP2a、PBP1、PBP2b、Fts Z、Fts A、Div IVA、Sep F、Map Z、Ezr A和Wih A。这些蛋白中只有部分被证实是STK的磷酸化底物,暗示STK可能还通过相互作用调控细胞分裂。