论文部分内容阅读
ML(MD-2-related lipid-recognition,ML)家族是含有ML单一结构域的蛋白家族,广泛存在于动物、植物和真菌等生物体内,成员包括MD-1(myeloid differentiation protein-1,MD-1)、MD-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)、 NPC2(nieman-pick type C2,NPC2)等以及很多尚未清楚功能的蛋白。MD-1和 MD-2是细胞表面受体识别细菌脂多糖所必需的因子,而其它ML蛋白也在脂类识别和代谢中发挥作用。
本实验在由白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染凡纳滨对虾所建立的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库所获得的EST(expressed sequence tag,EST)的基础上,使用cDNA快速扩增技术(rapid amplification of cDNA end,RACE)技术获得一个具有ML结构域的蛋白的全长cDNA,将其命名为LvML并对该基因的基因组结构、蛋白功能和表达谱等进行了进一步的研究。
通过基因组PCR(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到了约1873 bp大小的基因组片段,并在此基础上利用genome walking技术获得了ORF(open reading frame,ORF)上游近1100 bp的序列。分析表明LvML的基因由四个外显子和三个内含子组成。为了研究该基因的相关功能,将该基因克隆到pQE-30载体,构建了重组表达质粒pQE-30-LvML,在大肠杆菌M15中进行诱导表达,并纯化得到可溶性的带6xHis标签的融合蛋白。通过ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELJSA)方法检测重组蛋白对LPS(lipopolysaccharide,LPS)的结合活性。结果表明,原核表达的重组蛋白在5μg/ml的浓度以上,具有明显的LPS结合活性。
运用Northem blot和RT-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术检测了该基因在凡纳滨对虾各组织的表达情况。结果表明,该基因只在肝胰腺组织中高水平表达,在后盲囊中低水平表达,而在眼柄、鳃、血细胞、心脏、胃、肠、肌肉、神经索等组织未见明显表达。在此基础上,使用Northern blot和定量竞争性PCR(quantitative competitive PCR,QC-PCR)分析人工注射WSSV或LPS后,该基因在肝胰腺中随时间变化的表达谱。结果表明该基因的表达在LPS注射后5小时,及WSSV注射后12小时有明显的上调,随后下调至低于健康虾水平,在约30小时后达到最低点,然后逐渐恢复到健康虾水平。