戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是一种主要通过类-口途径传播的消化道传染病，在发展中国家常呈暴发流行或散发传播，在日本、美国和欧洲一些发达国家也有散发感染。戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是引起HE的病原体。 根据全基因组序列分析，HEV可分为4个基因型，以前我国HEV感染以HEV第1基因型为主，但近年我国发现了新的变异株，构成了HEV的一个新基因型，第4基因型。HEV基因组中开放读码框架2(ORF2)编码的病毒结构蛋白(pORF2)是诱导机体产生免疫反应的主要抗原，其羧基端存在多个具有免疫优势的B细胞表位，尤其是含有HEV的中和抗原表位，因而广泛应用于HEV感染的诊断及疫苗研究。 我们曾将HEV缅甸株(第1基因型)的中和抗原表位定位在其pORF2 aa452～aa617(p166Bur)，针对p166Bur的抗血清可中和或交叉中和来自HEV第1～3基因型的毒株，说明在HEV这3种基因型之间存在共同的抗原表位。但是有关HEV第4基因型抗原表位，特别是中和抗原表位的报道甚少，本研究对HEV第4基因型ORF2编码蛋白的抗原表位进行了分析，为研制适用我国的HEV诊断试剂和安全高效、适用面广的HEV基因工程亚单位疫苗提供科学依据。本研究实验内容分为3个部分： 一、抗HEV p166Chn单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAbs)的制备与鉴定 采用来自HEV第4基因型ORF2重组蛋白p166Chn(aa464～aa629)作为免疫原，常规免疫BALB/c雌性小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行体外融合，采用间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养孔上清，挑选抗-p166Chn阳性、同时与单独包被的纯化GST不反应的杂交瘤细胞孔作为阳性孔细胞，经2～3次亚克隆后获得稳定分泌McAbs的细胞株，并进行抗体特异性以及类、亚类、效价鉴定。最终共获得7株能稳定分泌抗-p166Chn McAbs的杂交瘤细胞株，命名和抗体类型为2F11(IgG2a)和1F8、1G6、1G10、2F12、3C2、3D2(IgGl)。在小鼠体内均可诱导高效价腹水，采用Protein-G亲合层析柱进行纯化并定量为1.9～5.2 mg/ml。HEV体外中和试验显示，7株McAbs均能中和HEV第4基因型毒株。提示所制备抗-p166Chn McAbs为中和性McAbs；HEV第4基因型ORF2编码蛋白p166Chn中存在中和抗原表位。 二、p166Chn抗原表位分析 首先以编码p166Chn的基因片段为模板，采用高保真PCR反应系统得到一系列相互重叠、不同长短的基因片段克隆入pGEx-4T-2载体构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达和GST-Sepharose4B亲和层析纯化，共制备22种p166Chn N端和/或C端截短的GST-ORF2融合蛋白。通过观察MeAbs和不同p166Chn截短蛋白的反应性，来确定所制备McAbs识别表位所依赖的肽链区段，ELISA和Western blot结果显示：抗-p166ChnMeAbs和p166Chn截短蛋白有2种反应类型，以1G10为代表的6株McAbs能与N端不短于aa477以及C端不短于aa613的截短蛋白反应，而McAb2F11则能与N端不短丁aa474、C端不短于aa617的截短蛋白反应，因此两类McAbs所针对的抗原表位都是构象依赖型表位，这也有力地佐证了我们先前认为p166抗原存在构象型表位的观点；分析能够和两类MeAbs呈阳性反应的p166Chn截短蛋白共有区段发现，1G10为代表的McAbs针对的表位依赖于aa477～aa613肽链区段，而2F11针对的抗原表位需依赖于较长的肽链区段(aa474～aa617)。这一发现有利于在将来HEV诊断试剂和疫苗的研制中，既保留有效的抗原活性位点，又能尽量去除免疫反应性低或是无关的蛋白成分，避免与其他病毒或体内组织抗原之间可能存在的交叉反应，以减少HEV检测中的假阳性，并可能提高疫苗免疫效果。 其次，我们通过抗-p166Chn McAbs之间的相加ELISA和竞争抑制试验，进一步证实了以上2类McAbs所针对的两个抗原表位在空间何置上的不同。然而更有意义的是，我们共使用了7种p166重组蛋白，涵盖了HEV4个基因型及不同亚型的主要参考毒株ORF2蛋向，来进一步观察其和所制备McAbs的反应性，结果发现两类McAbs不仅能与制备McAbs时免疫小鼠所用抗原p166Chn结合，还能与其他6种p166重组蛋白发生阳性反应，说明这两个抗原表位是不同HEV基因型共同性表位。 三、Leu477和Leu613定点突变对p166Chn抗原表位的影响 我们在前面的实验中发现，以1G10为代表的McAbs能与p166Chn N端不短于aa477以及C端不短于aa613的截短蛋白反应，而当N端再去掉一个氨基酸aa477或C端去掉aa613屙，从pN478开始的系列N端截短蛋白以及从pC612开始的系列C端截短蛋白和McAbs的反应性均消失。提示aa477和aa613很可能在1G10等McAbs识别的抗原表位构成中起到了关键的作用。提取GenBank中所有的HEV ORF2编码蛋白全长序列进行比对分析，发现所有序列在477位点和613位点都是疏水性的亮氨酸(Leu，L)，这种高度保守性也提示了两个氨基酸位点的重要性。我们进一步采用氨基酸定点突变法，分别将Leu477和Leu613单独或同时突变为性质相近或相异的氨基酸，比如疏水性的苯丙氨酸(Phe，F)、亲水性的苏氨酸(Thr，T)以及具有不同侧链长度和结构的缬氨酸(Val，V)、异亮氨酸(Ile，I)和色氨酸(Trp，W)。然后通过检测突变蛋白和抗-HEV McAbs的反应性，来观察477位点利613位点单点和/或双点突变对p166Chn抗原性的影响。结果单点突变蛋白L477T、L4771、LA77V、L613T、L613I、L613V、L613W和McAb的反应性明显下降，达50％～88％；而L477F、L613F以及L477W没有引起明显的抗原性改变：更有说服力的是，当两个位点同时突变为T或I时，突变蛋白抗原性较单个位点突变时下降更为显著，分别下降了78％和91％，同时突变为F，抗原性改变不大，与单点突变没有区别。说明aa477利aa613位点是构成1G10等McAbs所识别中和表位的关键氨基酸，其疏水性以及侧链长度和侧链基团的改变很可能改变了多肽链的折叠方式，并因此改变了抗原表位的空间构型，影响了抗原抗体的识别和结合作用。 综上所述，我们通过制备抗HEV第4基因型中和性单克隆抗体进行表位分析，结果表明在我国新发现的HEV第4基因型ORF2编码蛋白上至少含有2个不同基因型共同性的中和抗原表位，分别依赖于aa477～aa613和aa474～aa617肽链片段，具有构象依赖性特征，aa477和aa613位点是表位形成中的关键氨基酸。这将丰富HEV研究成果，并有助于高效、适用面广的HEV疫苗的研制。